ELISA实验“温育"操作是不是只能在37℃条件下完成

 

　　温育是ELISA试剂盒测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。ELISA实验作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，也被称之为孵育。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。

　　温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达。为加速反应，可提高反应的温度，ELISA试剂盒有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为*，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中放置一晚上，以形成zui多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

　　ELISA试剂盒操作步骤(通用)：

　　1. 加标准品：在酶标包被板上设标准品孔，ELISA试剂盒 依次加入不同浓度的标准品50ul(建议每个浓度做2个平行孔)人ELISA试剂盒。

　　2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。大鼠ELISA试剂盒在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加样品亲和素10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀小鼠ELISA试剂盒。

　　3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟ELISA试剂盒。

　　4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

　　5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，大鼠ELISA试剂盒每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干小鼠ELISA试剂盒。

　　6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外ELISA试剂盒。

　　7. 温育：操作同3。

　　8. 洗涤：操作同5。

　　9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟人ELISA试剂盒.

　　10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转)。

　　测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

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