技术方法：荧光素FITC标记抗体的方法
 

　　常用Marsshall(958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(963)的透析标记法。

　　1.Marsshall法

　　(1)材料 抗体球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、%硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.0mol/LPBS等。

　　(2)方法及步骤

　　①抗体的准备 取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使zui后免疫球蛋白浓度为20mg/ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的/0，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～0min。

　　②荧光素的准备 根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.0mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a.蛋白溶液：含量Amg/m;容积Bml。 b.总蛋白量(AXB)=Crag。 c.C/20～C/0=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml，用C/0;如高于20mg/ml，用C/20)。 d.荧光素FITC的量：(/50～2/00)XC=Emg。 e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D/0=Fml。 f. PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg/ml;B为蛋白质溶液的容积;C为蛋白总量，mg;D为常数，mg;正为荧光素的量，mg;F为碳酸盐缓冲液的容积，ml;G为PBS的容积，ml。

　　③结合(标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—0min内加完)，加完后，继续避光搅拌2h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。

　　④透析 结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r/min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。

　　⑤过柱 取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.0mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2);过滤量：2ml标记蛋白液(过滤前未透析);收集量：20ml(稀释.7倍左右)。

　　2.Chadwick法

　　(1)试剂和材料 抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0.0mol/L pH8.0PBS、%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等。

　　(2)方法及步骤

　　①抗体准备 用o～4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。

　　②荧光色素准备 按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.0rug计算，称取所需的荧光素，用3%碳酸钠水溶液溶解。 ③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C冰箱中结合(在磁力搅拌机上持续搅拌)8～24h。

　　④透析和柱层析 方法同Marsshall法。

　　3.改良法

　　(1)试剂和材料

　　①0.0mol/L(pH7.2)PBS配法中，校定pH至7.2。NaCi 8g、Na2HP04 .5g，溶于2000ml蒸馏水

　　②0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液配法 取0.5mol/LNazCOs(5.3%)0ml加入0.5mol/LNaHC03(4.2%)90ml，混合后，校定pH至9.0。

　　③3%碳酸钠水溶液配法 称L 5g充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

　　④其他试剂和材料 l%叠d化钠、离心机及离心管、烧杯(25m)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m)透析袋等。

　　(2)方法及步骤

　　①取价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0.5mol/LNaCl)及缓冲液(0.5mol/LNaHC03—Na2C03，pH9.0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的0%，降温至4℃。

　　②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素=(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C下电磁搅拌2～4h。

　　③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。

　　④将制备好的荧光抗体加叠d化钠o.0%，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可达2年以上。

　　4.透析标记法 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。试剂和材料 试剂和材料同改良法。

　　(2)方法及步骤 ①用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0，将欲标记免疫球蛋白稀释成%浓度，装入透析袋中。

　　②用同一缓冲液将FITC配成0.mg/ml的溶液，按0mg/ml球蛋白溶液体积的0倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。

　　③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。

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