Elisa实验：ELISA实验中酶标记抗体的制备方法
 

　　酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成，酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法.目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应，高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质目模作简便易行的方法。

　　酶标记抗体的制备方法：

　　酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醒交联法和过碘s盐氧化法

　　(1)戊二醒交联法:戊二醒是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷联般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醒直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。

　　ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%) 和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗本与抗体之间也有可能交联，影响效果，在两步法中，先将酶与成二醒作用，透析除去多余的成二醒后，再与抗体作用而形成酶标抗体，也可先将抗体与成二醒作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较步法低。

　　(2)过碘盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法，反应时，过磺获将HRP分子表面的多糖氧化为醒基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schif氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为: 酶抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。

　　按以上方法制备的酶结合物一股都混有末结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的疆活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色，但游离的抗体则不司，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量，因此制备的酶结合物应子纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸被盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分: 游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。

　　酶标记抗体结合方法：

　　结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度，使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高;结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能是到阳性反应的最高程程度。例如某一HRP，抗人10G制别标明的工作浓度为15000，表不该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行 滴配 选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度

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