【古朵生物】选择elisa试剂盒方法及试剂盒反应要素
 

　　一、检测方式

　　如今检测ELISA试剂盒有许多途径，我们可以根据自己的偏好进行选择。一般ELISA检测的是酶促反应的可溶性产物，抗体上结合有相应的酶，而反应体系中添加有相应的底物。这种酶促反应生成具有特征性的颜色，可以通过分光光度计进行检测，碱性磷酸酶ap也是一种常用酶。酶可以结合在一抗上，也可以结合在二抗上，还可以使用链霉亲和素标记的酶与亲和素标记的一抗结合。此外ELISA结果检测还包括放射性检测、荧光检测、化学发光或显色法检测等。

　　二、实验类型

　　虽然有多种类型，不过它们都有一个共同特点，就是进行抗原捕获。一般捕获形式包括将抗原吸附到微孔板或者用微孔板上的抗体进行捕获。in-cell Elisa和酶联免疫斑点elispot是两种特殊的类型，in-cell Elisa需要将微孔板中培养的细胞进行固定和通透化，然后再用抗体原位检测。elispot有点像蛋白印迹western blot，先在带膜的微孔板中培养细胞，然后在膜上检测细胞分泌的抗原形成斑点。此外，我们还需要根据自身需要选择96孔板或是48孔板进行Elisa实验。

　　三、抗体类型

　　单克隆抗体和多克隆抗体都能够用于Elisa检测，实际上有时候二者结合效果更好。例如，对于双抗夹心法而言，用多抗进行捕获而单抗进行检测有时更有帮助。多抗能够确保捕获所有抗原，随后单抗再特异性检测拥有特定抗原表位的抗原。

　　四、交叉反应

　　如果抗体间发生冲突或交叉反应就会影响整个实验的特异性。其中抗体来源所带来的兼容性就是交叉反应的一个因素。尽管现在购买源自zhi定动物的抗体越来越容易，我们仍有必要确认一下是否会产生交叉反应的问题。在用双抗夹心法进行Elisa检测时，检测用的二抗必须特异性针对检测一抗，而不能与捕获抗体起反应。如果检测用二抗与捕获抗体结合，实验特异性就会大打折扣。通常我们选用源自不同宿主的捕获抗体和检测一抗，来避免上述问题。

　　ELISA试剂盒反应五要素：

　　引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应 遵循以下原则：

　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

　　⑤引物3'端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

　　引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

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