技术文章：五色染色法结缔组织染色试剂盒
 

　　五色染色法结缔组织染色试剂盒100次

　　运输：常温  保存：常温

　　有效期：1年

　　实验原理：

　　抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

　　实验步骤：

　　(一)脱蜡和水化：

　　(二)抗原修复：

　　(三)免疫组化染色SP法

　　(四)SABC法

　　免疫组化问题解答

　　1、染色过强

　　a 抗体浓度过高戒孵育时间过长 。降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时、或4度过夜

　　b 孵育温度过高超过37度。 一般在室温20-28度 c DAB显色时间过长戒浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准。

　　2、非特异性背景染色

　　a 操作过程中冲洗不充分 ：每步冲洗3次每次5分钟。

　　b 组织中含过氧化物酶未阻断：可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长。

　　c 组织中含内原性生物素：正常非免疫动物血清再封闭。

　　d 血清蛋白封闭不充分：延长血清蛋白封闭时间。

　　3、染色弱

　　a 抗体浓度过低、孵育时间过短：提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟。

　　b 试剂超过有效使用时间：应更换试剂。

　　c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干：每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释(应防止切片干燥)。

　　d 室温太低：低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟，或4度冰箱过夜。

　　e蛋白封闭过度：封闭不要超过12分钟。

　　4、染色阴性

　　a 操作步骤错误：应重试、设阳性对照。

　　b 组织中无抗原：设阳性对照以验证试验结果。

　　c 一抗不二抗种属连接错误：仔细确定一抗二抗种属无误。

　　免疫组化操作要点及技巧

　　1、固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好;但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

　　Bouin S固定液：饱和苦味s750ml，甲醛250ml，冰醋s50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。

　　PLP液：即高碘s钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

　　2、组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

　　3、切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

　　4、烤片：60℃ 30分钟戒37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

　　5、蜡块及切片的保存：最好在4℃保存 。

　　6、脱片问题：

　　Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

　　7、灭活内源性酶：HRP系统：3%双y水灭活;AP系统：3%HAc灭活。

　　8、暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对不同组织，不同抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

　　9、封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时或用浓缩血清封闭

　　10、抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对亍PBS稀释的抗体一定要当天使用。

　　11、背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色前要多洗。

　　12、返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液(如PBS)戒Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

　　13、显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

　　14、在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

　　15、拍照

　　免疫组化技术的关键问题

　　1.组织处理

　　2) 组织脱水、透明、浸蜡

　　2.切片

　　2)明胶硫酸铬钾法

　　3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅w)

　　3.免疫组化染色

　　2) 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

　　3) 每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。

　　4) PBS冲洗3×3’。

　　5) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。

　　6) 甩去血清，每张切片加1滴或50ul的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟戒4℃过夜，建议参阅每种抗体的说明书。

　　7) PBS冲洗3×5’。

　　8) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟。

　　9) PBS冲洗3×3’。

　　10)甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。

　　11)PBS冲洗3×3’。

　　12)甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。

　　13)自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCL分化，0.1%a水或PBS冲洗返蓝。

　　14)如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，(二甲b透明)，中性树胶封固;如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

　　免疫组化染色注意事项

　　免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事，但最基本的应从以下方面加以注意：

　　(1)去除内源酶及内源性生物素

　　1) 去除内源酶

　　2) 去除内源性生物素

　　3)灭活碱性磷酸酶

　　(2)抑制非特异性背景着色

　　(3)缓冲液

　　(4)抗原修复

　　免疫组化染色

　　一.石蜡切片免疫组化染色实验步骤：

　　1.石蜡切片脱蜡至水：(石蜡切片染色前应置60℃ 1小时)。

　　2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟(避光)。

　　3.蒸馏水洗：5分钟，2次(置于摇床)。

　　4.抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。

　　

 

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