古朵分享：ELISA试剂盒的注意事项、操作过程、为什么变质?
 

　　一、ELISA试剂盒的注意事项：

　　1、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温标准。使用后立即冷藏保存试剂。

　　2、洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

　　3、消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

　　4、底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

　　5、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

　　6、在储存和温育时避免强光直接照射。

　　7、平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

　　8、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

　　9、如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

　　ELISA试剂盒操作过程：

　　1.取出酶标板，设空白孔，按照次第对应别离参加μl的规范品于空白微孔中(空白孔视为0号规范品，用医用蒸馏水代替)

　　2.别离标记样品编号，参加μl的稀释样品于空气微孔中(不同的样本选用不同的吸头)。

　　3.将酶标板置于37℃温育30分钟

　　4.将酶标板板取出，将其间的液体甩去，每个孔中悉数加满使用洗刷液后，当即甩去液体。

　　5.每个孔中加满使用洗刷液后，细微振摇酶标板30秒后将孔中的使用洗刷液甩去，在吸水纸大将酶标板拍干。

　　6.重复第5个过程5次，在吸水纸大将酶标板拍干。

　　7.在规范品孔和样品孔中参加的μl的酶标巧合溶液。

　　8.将96孔板置于37℃温育30分钟。

　　9.将酶标板取出，将其间的液体甩去，每个孔中悉数加满使用洗刷液后，当即甩去液体。

　　10.每个孔中再次加满洗刷使用液后，室温细微振摇酶标板30秒后将孔中的使用洗刷液甩去，在吸水纸大将酶标板拍干。

　　11.重复第5个过程5次，在吸水纸大将酶标板拍干。

　　12.在每个孔中参加底物A 50μl后当即参加底物B 50μl。悄悄振动混匀。(A液.B液使用不同的吸头加样)

　　13.将酶标板置于37℃避光温育反响15分钟。

　　14.每个微孔中参加50μl的停止液，悄悄振动混匀。

　　15.在酶标仪上，450nm处测定OD;显色后，15分钟内进行测定。

　　16.依据制备的规范曲线，核算样本含量。

　　ELISA试剂盒为什么变质：

　　ELISA试剂盒为什么会变质呢?是什么影响了ELISA试剂盒质保?一旦变质会有什么影响呢?

　　1.方法学的影响

　　ELISA测定模式包括以下几种：双夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。

　　2.试剂因素

　　不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，即使是通过批批检的项目其检测结果也存在差异，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性;对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，避免反复冻融造成试剂的失效。

　　3.样本因素

　　标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素，前者包括类风湿因子、补体、异嗜性、自身、溶菌酶等，后者包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等。

　　4.操作因素

　　ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。加样、温育、洗涤、显色、比色。

　　5.灰区的设置

　　通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”(cut-off value，CO值)，这是定性免疫测定结果报告的依据。

　　6.标本复查

　　ELISA手工检测过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果的差异，因此加大复查力度是保证结果准确性的可靠方法，比如对HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等项目的可疑、弱阳性标本及少见模式的检测结果进行复查。

　　7.常表示结果的常用方法

　　定性测定

　　半定量测定 结果一般以滴度表示。

　　定量测定 即用已知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，绘制标准曲线，结果以量或单位表示。

　　在ELISA定量检测中每一块反应板都必须绘制相应的标准曲线。

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