PCR原理、分类、应用及PCR实验中常见问题解决方法

　　PCR 或聚合酶链式反应是分子生物学中用于创建特定 DNA 片段的多个副本的技术。通过PCR仪进行PCR 使产生数百万份 DNA 小片段成为可能。所以PCR仪也是分子生物学和生物技术实验室常用于见的实验室设备。

　　PCR的原理

　　PCR 技术基于 DNA 的酶促复制。 在 PCR 中，使用引物介导的酶扩增一小段DNA 。DNA 聚合酶合成与模板 DNA 互补的新 DNA 链。DNA 聚合酶只能将核苷酸添加到预先存在的 3'-OH 基团上。因此，需要一个底漆。因此，更多的核苷酸被添加到 DNA 聚合酶的 3'''末端。

　　PCR实验主要由三部分所组成：

　　1.DNA 模板– 样本中单链DNA。

　　2.DNA 聚合酶–使用 Taq 聚合酶。Taq聚合酶属于热稳定酶，在较高的温度下不会变性。

　　3.寡核苷酸引物s - 这些是与单链和反链的 3' 末端互补的短链单链 DNA。

　　4.脱氧核糖核苷酸三磷酸——它们为聚合提供能量，是 DNA 合成的基石。

　　5.缓冲系统——镁离子和钾离子为 DNA 变性和复性提供了良好的环境条件。它对于保真度、聚合酶活性和稳定性也很重要。

　　

 

　　PCR的基本类型

　　PCR有以下几种类型：

　　1.实时荧光定量 PCR

　　实时荧光定量 PCR，在荧光检测系统的帮助下实时检测 DNA 扩增。荧光报告基因的信号强度与扩增的 DNA 分子数量成正比。该实验中所使用的PCR仪器一般是荧光定量PCR仪。

　　2.嵌套 PCR

　　通过嵌套PCR可以提高样本的敏感性和特异性。由于意外引物结合位点的扩增，减少了产物的非特异性结合。

　　3.多重PCR

　　使用多通道高通量的PCR仪可以实现同时扩增许多不同的 DNA 序列。也可以用于在单个 PCR 实验中扩增多个目标。

　　4.定量 PCR

　　定量PCR主要用于通过 DNA 扩增线性来检测、表征和量化样品中的已知序列。

　　PCR基因扩增步骤

　　PCR PCR基因扩增主要经过3个循环反应：

　　变性

　　当反应混合物加热至 94℃ 约 0.5 至 2 分钟时发生变性。这会破坏两条 DNA 链之间的氢键并将其转化为单链 DNA。此时，单链作为产生新 DNA 链的模板。此阶段应提供较长时间的温度以确保DNA链的解离。

　　退火

　　通过PCR仪设定的程序将反应温度降至54-60℃约20-40秒。在这里，引物与模板 DNA 上的互补序列结合。引物是长度约为 20 至 30 个碱基的 DNA 或 RNA 的单链序列。

　　引物是 DNA 合成的起点。DNA链分开后以相反的方向运行，因此引物设计一般有两个，即：正向引物和反向引物。

　　延伸

　　在这一步，温度升高到72-80℃。Taq 聚合酶将碱基添加到引物的 3' 端。

　　这会在 5' 到 3' 方向上拉长 DNA。DNA聚合酶在适宜的温度下增加约1000bp/分钟。

　　Taq 聚合酶可以耐受较高的温度。它附着在引物上并将 DNA 碱基添加到单链中。从而获得了双链DNA分子。

　　这三个步骤一般重复 20-40 次，即可在短的时间内获得许多目标的 DNA 序列。

　　ELISA上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。古朵试剂盒