ELISA实验“温育”操作是只能在37℃条件下完成吗?

　　  温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。ELISA实验作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，也被称之为孵育。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。

　　  温育的时间选择

　　  温育这一步是ELISA测定中容易出现问题的步骤。目前国内ELISA试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟-1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1-2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。

　　  ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

　　  温育的温度选择

　　  温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用高的温度。抗原抗体反应4℃为*，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中放置一晚上，以形成zui多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

　　  在建立ELISA方法作反应动力学研究时，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用高的温度。抗原抗体反应4℃为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

　　  温育的方式选择

　　  温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异(“边缘效应”即外周孔显色较中心孔深)。可将ELISA板置于水浴箱中，板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。

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