原理介绍: 酪酰胺信号放大(TSA， Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶( HRP) 对靶蛋白进行标记的酶学检测方法， 类似常规免疫组化的 DAB 显色方法 ， TSA 技术同样采 用 HRP 标记的二抗， 同样有对应的 “显色"步骤 (HRP 催化加入反应体系的酪胺荧光素底物， 产生 活化荧光底物， 活化底物可与抗原上的酪氨s等残基共价结合， 使样品上稳定的共价结合酪胺荧光 素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP 复合物， 重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵 育， 换另一种酪胺荧光素底物， 如此往复就可实现多重标记。

　　  TSA 详细原理是利用酪胺 Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在 HRP 催化 H202 下形成共价键结合位点)， 产生大量的酶促产物， 该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨s、 组氨s和酪氨s残基)结合， 这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积， 结果使其检测信号得到 10-100 倍增强。

　　  简单来说， 用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP (而不是直接偶联荧光素) ， 来催化后续 添加入体系的非活性荧光素。 荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化， 跟临近蛋白的酪氨s残基共价偶联， 使得蛋白样品与荧光素稳定结合。 然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价 结合的抗体被洗掉， 共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。 再换个一抗来第二轮孵育 ， 周而复始。 等到所有抗体孵育结束， 荧光素都结合好后， 后去检测结果。 由于每次体系中都只有单 一抗体孵育， 因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题， 大大减少了实验设计时不同 种属抗体选择匹配的限制。 也就是说， 如果用 TSA 技术， 同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性 高的兔单克隆抗体。 搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验， 而且信号放大的倍数大大增强。 本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种： 480， 520， 570 ， 620， 690， 780， 488， CY3.此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。 可以实现单标、双标、三标以及多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

　　  试剂盒组成： 488 荧光染料(绿光)(即用型， 5mL),-20℃; CY3 荧光染料 (红光) (即用型， 5mL)， -20℃; TSA+增强剂， 100ul， -20℃ (可选) ;

　　  高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (5mL) 4℃。

　　  备注： 488 荧光染料 、CY3 荧光染料 在-20 度下， 均为固体， 使用之前需解冻。

　　  TSA+增强剂使用方法： TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号 5-10 倍， TSA+增 强剂： 荧光放大液=1:500， 使用 TSA+增强剂不是必须的选项， 可以根据具体的情况选择添加或者不选择添加。

　　  试剂盒1、 石蜡切片脱蜡至水： 依次将切片放入二甲b Ⅰ 15min-二甲bⅡ15min-无水乙醇 Ⅰ5min-无水乙醇 Ⅱ。 取出放在通风厨内， 酒精晾干后放入自来水中稍洗， 蒸馏水洗。

　　  2、 抗原修复： 组织切片置于盛满 PH 9.0 EDTA 碱性抗原修复液或者 PH6.0 柠檬酸修复缓冲液的修复 盒中于微波炉内进行抗原修复 (也可以用高压 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 热修复方法) 。 中火 8min， 停火 8min， 转中低火 7min， 此过程中应防止缓冲液过度蒸发， 切勿 干片。 自然冷却后将玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 (修复液 和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定) 。

　　  3 、 阻断内源性过氧化物酶： 切片放入 3%过氧化氢r液， 室温避光孵育 15 min， 将玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。

　　  4、 BSA 封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈 (防止抗体流走) ， 在圈内滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封闭液) 均匀覆盖组织， 室温封闭 30min。

　　  5、 加一抗： 轻轻甩掉封闭液， 在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗 X， 切片平放于避光湿盒 内 4°C 孵育过夜或者 37 度 1-2h。 (湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

　　  6、 加 hrp 二抗： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织， 避光室温孵育 50min， PBS 洗三次。

　　  7、 荧光染料反应： 488 荧光染料 (或者 CY3 荧光染料) 反应 10-15min， PBS 洗三次。

　　  8、 重复 2-7 步骤 (换用另外一种 荧光染料)

　　  9、 DAPI 复染细胞核： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈内滴加 DAPI 染液， 避光室温孵育 10min。

　　  10、 封片： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 荧光淬灭封片剂封片。

　　  11、 镜检拍照： 切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图 像。

　　  染料 激发波长 发射波长

　　  DAPI 蓝色 350 420

　　  480 450 480

　　  488 绿色 480-490 512-520

　　  CY3 红色 530-550 570-590

　　  520 绿色 490 520

　　  570 红色 550 570

　　  620 590 620

　　  690 630 690

　　  780 750 780

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