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技术分享篇:荧光定量PCR(qPCR)——引物
人阅读 发布时间:2023-11-14 14:12
技术分享篇:荧光定量PCR(qPCR)——引物
qPCR实验中,引物设计也是非常重要的一个环节,引物的合适与否与扩增效率是否达标、扩增产物是否特异、实验结果是否可用等息息相关。
那么如何使qPCR引物特异性佳?扩增效率高?
古朵生物技术小编先带您一起设计qPCR引物,让qPCR引物设计成为实验中的高效绝杀技能。
设计qPCR引物时,通常要留意以下几点:引物尽量要跨内含子设计、产物长度100~300 bp、Tm值尽量接近60℃且上下游引物尽量接近、引物末端是G或C等等。
1. 引物跨内含子设计
在设计qPCR引物时,选择跨内含子设计的引物可以使gDNA模板不能得到扩增,产物均来源于cDNA的扩增,这样也就去除了gDNA污染造成的影响。
2. 引物长度
引物长度一般在18~30 nt之间,扩增产物长度尽量控制在 100~300 bp之间。
引物设计太短会导致非特异扩增,太长则容易形成二级结构(如发夹结构)。扩增产物太长不适于聚合酶进行反应,会影响到PCR扩增效率。
3. GC含量和Tm值
引物GC含量控制在40%~60%之间,过高或过低都不利于引发反应。正反向引物GC含量应接近相同,以便获得相同的 Tm值和退火温度。
Tm值应尽量在55~65℃之间,一般为60℃左右,上下游的Tm值应尽量姐接近,不超过4℃。
4. 引物3′端末端避免选择A
引物3′端错配时,不同碱基引发合成效率存在着很大的差异,当末位碱基为A时,即使在错配的情况下,也能引发链合成,而当末位为T时,错配引发效率大大降低。因此引物3’端尽量避免选择A,以选择T代替。
若为探针引物,则探针5’端不能为G,因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时,G也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号,从而导致假阴性的出现。
5. 碱基分布
引物中四种碱基的分布是随机的,3′端避免超过3个连续的G或C,3个以上连续的G或C容易在GC富集序列区产生配对。
6. 引物设计区域应避开复杂二级结构。
扩增产物单链形成二级结构会影响PCR顺利进行,可通过提前预测靶序列是否存在二级结构,尽量避开该区域设计引物。
7. 引物自身和引物之间应尽量避免碱基连续互补。
引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物自身不应存在互补序列,否则会自身折叠形成发夹结构,而影响引物与模板的复性结合。
上下游引物之间也不能存在互补序列,引物之间互补会产生引物二聚体而降低PCR效率甚至影响定量准确性。如果引物二聚体及发夹结构不可避免,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5 kcal/mol)。
8. 引物扩增的是目标特异产物。
qPCR检测最终目的是了解目的基因的丰度,如果出现非特异扩增,定量会不准确。所以设计好引物后,需要对其进行BLAST检测,在序列数据库中比对产物的特异性。
下面,我们以人GAS6(Growth arrest specific 6)基因为例,设计qPCR引物。
01查询基因
首先,通过NCBI查询Homo GAS6的基因,这里要注意对比基因名称、种属,确保都要一致。
2 找到基因序列
(1)若目标序列为基因组DNA,则选择第一个,为该基因的基因组DNA序列。
(2)若目标序列为mRNA,则选择第二个,进入后,点击如下表的”CDS”,棕色背景序列即为该基因的编码序列。
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