ELISA实验注意事项以及常见问题解答

　　酶联免疫吸附测定(ELISA)被称为免疫测定金标准。是一种免疫学测定方法。ELISA是用于测定抗原抗体，根据样本不同的类型和检测方法来进行相应的制定。主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、双抗原夹心法。

　　双抗体夹心法是常用的ELISA检测类型，它是利用一个抗体进行捕获，另外一个抗体进行检测。双抗体夹心法具有高特异性和高灵敏度，非常适用于复杂样本，但夹心法通常检测时间较长，难度大于其他方法。

　　一、双抗夹心法实验步骤：

　　二、双抗夹心法实验操作注意事项：

　　1、样品稀释：

　　(1)稀释血清避免假阳性的发生(把蛋白按照一定的倍数稀释，如10倍、20倍，将抗原进行稀释包被反应;用稀释好的阳性参阅血清和阴性参阅血清进行孵育后洗刷，加入酶结合物进行反应，孵育洗涤，加入底物显色，停止反应后分别测定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀释度为适合的包被浓度。阴性参阅血清O.D值<0.1-0.2。这样阳性参阅血清和阴性参阅血清的O.D值就会有明显差别)。

　　(2)粉末型样本需要短暂离心，如沾到管盖、管壁需要将标准品沉入管底;加入蒸馏水时需短暂轻柔涡旋，静置10-30min，充分溶解。

　　(3)加水后等待充分溶解后可选择吸吹或涡旋混匀。

　　2、试剂平衡：

　　(1)所有的试剂和样本需平衡至室温5-10min，避免产生动力学反应差异这会影响准确性。

　　3、混匀：

　　(1)稀释前、后的样品需进行摇床充分混匀。

　　4、加样操作：

　　(1)定期校准移液抢。

　　(2)加样前需混匀，避免加入到孔壁上，尽可能避免气泡产生。

　　(3)避免样本溅出(可用吸水纸吸取溅出液体)。

　　(4)避免加样枪头反复吸取导致样本污染。

　　(5)加样操作按照说明书的顺序来进行，确保显色时间一致。

　　5、孵育：

　　(1)震荡孵育，加快抗原抗体之间的相互接触，使反应更加充分。

　　(2)水浴温度保持37℃。

　　(3)水浴需要封闭防止污染。

　　6、洗板：

　　(1)洗液尽量不要溢出孔外。

　　(2)拍过酶标记物后及时更换吸水纸，避免影响实验的准确性。

　　(3)手工洗板时拍板要垂直且用力不能过猛，可避免交叉污染。

　　(4)扣干后的酶标板应快速加液，避免干板太久。

　　(5)采用全自动时需检查各项水瓶是否充足。

　　(6)采用全自动时检查是否堵塞。

　　7、显色：

　　(1)显色需控制好时间(根据说明书操作),时间过短,结果偏低;时间过长,空白增高/非特异性显色增加。

　　(2)显色呈梯度。

　　8、比色：

　　(1)跟换滤光片时注意错用的可能性。

　　9、检测：

　　(1)酶标仪使用前预热10-15min，结果更稳定。

　　(2)双波长测定吸光值，可以减少指纹、杂质等带来的误差(检测波长450nm-参考波长630nm(570nm))。

　　二、试剂盒选择注意事项：

　　1、选择明确：

　　(1)样本种属类型

　　(2)样本类型：

　　2、样品中检测物水平选择：

　　(1)宽动力学检测范围：对样品种待测物水平没有任何参考数据。

　　(2)高灵敏度试剂：待检物含量很低。

　　3、样品获得性选择：

　　(1)通常试剂盒的样品用量在40μL或100μL，少部分用量20μL左右。

　　4、试剂盒技术参数选择：

　　(1)回收率达到80-120%之间。

　　(2)按照国际标准示值误差：100μg。

　　(3)误差系数<5%-8%。

　　(4)建议优先考虑双单抗。

　　(5)操作方便

　　三、常见问题解答：

　　1、样本的处理、收集和保存问题：

　　(1)细胞培养上清通过离心收集，分装保存，温度-20℃。

　　(2)血清样本分离管分离血清，样本凝集30min后离心，吸取血清立即检测，分装保存，温度-20℃。

　　(3)血浆样本采用EDTA收集样本，需在30min内离心，吸取样本立即检测，分装保存，温度-20℃。

　　(4)避免选择严重溶血或高血脂样本，收集后快速检测并储存，若未能在24h内检测，可暂时存放2-8℃。

　　(5)分析前样本需缓慢恢复至室温，注意是否有沉淀物需祛除干净。

　　2、样本反复冻融，具有哪些影响：

　　(1)蛋白易降解。

　　(2)细胞上清冻融1-2次后，蛋白降解严重。

　　3、阴性对照和空白对照的区别：

　　(1)空白对照：稀释液代替样本，检测显色本地，读取阳性、阴性、样本孔的吸光值。

　　(2)阴性对照：样本与待检测物具有同源、同质性，但不含有待检测物质，可鉴别处理因素之间的差异性。

　　4、添加显色后，无色或阳性对照弱：

　　(1)试剂盒需采用同批次。

　　(2)注意稀释倍数是否正确。

　　(3)酶结合物是否未添加。

　　(4)试剂是否添加错误。

　　(5)显色液是否变质。

　　(6)确认各项容器干净无污染。

　　(7)注意配置时看清标签和说明书。

　　(8)观察液面高度是否一致，避免试剂漏加。

　　5、样本浓度不正确：

　　(1)标曲是否适合，有无失效等。

　　(2)样本含量或灵敏度较低无法被检测到，浓缩样本。

　　(3)样本含量或灵敏度较高，超过标曲浓度需稀释样本。

　　6、为什么吸光值过高：

　　(1)若如绝对值正确，则显色过高。

　　(2)波长选择错误，可选择双波长检测。

　　7、为什么吸光值低：

　　(1)样本未充分溶解，(混匀后需静置30min)。

　　(2)样本反复冻融，活性减弱。

　　(3)孵育的温度和时间为满足要求(按照说明书操作)。

　　8、无梯度：

　　(1)样本污染，需要跟换样本。

　　(2)稀释倍数错误，重新做。

　　(3)抗体浓度高，更换抗体或稀释。

　　(4)底物孵育是否时间和温度过短。

　　(5)孵育需封盖。

　　实验结果汇总事项：

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