细胞冻存与复苏操作步骤与注意事项

　　细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

　　一、原理

　　在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

　　细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞易受损的-5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

　　目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

　　二、细胞冻存与复苏操作步骤

　　(一)冻存

　　1、消化细胞(同实验二)，将细胞悬液收集至离心管中。

　　2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

　　3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

　　4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

　　5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

　　6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

　　7、按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。

　　注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

　　(二)复苏

　　1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

　　2. 培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱37°C预热20min，备用。

　　3. 二甲基亚砜(DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min，备用。

　　4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400°C水浴中，快速摇晃，直至冻存液*融化。

　　5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心(1000r/min，5min)。

　　6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

　　7. 记录复苏日期。

　　三、注意事项

　　1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

　　2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是*无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液*融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜(DMSO)选择进口产品。

　　3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

　　4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO)，DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。

　　5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

　　6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

　　7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1%。所以如果你的冻存液的浓度是 10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

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