酶联免疫检测中：ELISA试剂盒操作要点

　　在进行酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)实验中，有很多需要注意的地方，由于ELISA方法广泛应用在各种抗原和抗体的此定中。但是测定中的影响因素很多，并且对操作有较高的要求，所以，在实验中除了正常的相互反应，还会出现错误的反应，导致错误的结果。

　　而造成这种错误的可能因素有：标本因素;试剂因素;操作因素等。

　　为此，本司针对常见问题做分析如下：

　　ELISA 试剂盒标准操作要点

　　无论在什么研究中，的试剂、良好的和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的纯化水电导率小于1.5μs/cm。

　　A 标本的采取和保存

　　大部分ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。

　　保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。抗凝不*的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。

　　B 加样

　　加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

　　C 保温

　　在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。

　　D 洗涤

　　洗涤在ELISA试剂盒过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙x等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是zui主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

　　洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙x载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率在1.5us/cm之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。

　　E 显色和比色

　　TMB经HRP 作用后，约40分钟显色达，随即逐渐减弱，至2 小时后即可*消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，*次在zui适波长(W1)，第二次在不敏感波长(W2)，两次测定间不 移动ELISA 板的位置，zui终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

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