免疫组化遇到的问题及其解决办法
 

1、染色过强

 

原因	解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长	降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃	一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高	显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准

2、非特异性背景染色

 

原因	解决办法
操作过程中冲洗不充分	每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断	可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性生物素	正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分	延长血清蛋白封闭时间

3、染色弱

 

原因	解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短	提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期	及时更换试剂
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释	每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃	若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度	封闭时间不要超过10分钟

4、染色阴性

 

原因	解决办法
操作步骤错误	重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原	设立阳性对照片，以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误	仔细确定一抗与二抗种属无误

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