技术资料| 多色流式中荧光补偿调节方法与步骤
 

　　尽管多色流式细胞术目前已被广泛应用，但是荧光补偿的准确调节却是很多人实验中遇到的一大难题。

　　我们先来看看为何要做荧光补偿这个动作?

　　每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发射光谱会发生重叠，“荧光补偿”是指修正荧光渗漏的过程，从某个探测器除去除匹配荧光以外的其他任何荧光信号的过程即为荧光补偿。荧光补偿过程从原理上来说相对简单，但实际上涉及许多精细、敏感的方面从而使在实践操作相当复杂。

　　

 

　　正确的荧光补偿对于许多流式分析来说绝对是至关重要的，特别是对于目前常见的多抗原荧光表达强度分析。补偿调节不准确不仅会使细胞分群不明显，图片不漂亮;甚至影响结果比例，而且还会让审稿人有拒稿的理由哦!

　　今天我们就跟古朵生物技术小编一起以Annexin V-FITC/PI 检测凋亡为例来学习荧光补偿的调节方法和步骤吧!

　　首先要注意同批次实验每个荧光参数必须要设置单染管对照;

　　其次补偿调节样本必须可染出一群强阳性(或一群阳性和一群阴性)，以比较它们之间的平均荧光强度，这样补偿调节方可准确。故本例中我们使用凋亡阳性质控细胞作为样本。

　　步骤：

　　1. 空白管上样，调节FSC/SSC找到细胞;调节FL1/FL2的电压使所有细胞都位于左下象限，确定FL1/FL2十字门位置;

　　2.上PI单染管，调节FL1-FL2的补偿

　　3. 上Annexin V- FITC 单染管，调节FL2-FL1补偿

　　4. 根据Annexin V-FITC 与PI 的位置，重新调整十字门位置

　　5. 用阳性样品双染管检查调整后的十字门位置：阴性群和阳性群在相邻通道的MFI一致或接近(横平竖直);

　　到此FITC和PI两个通道的补偿即已调整好，接下来可以直接上样本进行检测喽!其他荧光素的补偿均可参考该步骤。

　　那么如果样本比较珍贵，不舍得做单染对照?目的抗原表达峰度低，无法获得明显的阳性群?补偿该如何调节呢?针对这些问题，补偿微球应运而生，已经很好的解决了这些难题。

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