细胞冻存和复苏需要注意什么?

　　细胞冻存：

　　1. DMSO配制的时候会放热，一定要等冻存液冷却后使用，避免灼伤细胞;

　　2. 细胞离心后，尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液;

　　3. 不建议手动梯度降温，因为温度不稳定，容易降低存活率;

　　4. 程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线;冻存5次后，异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果;程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用，不能从冰箱拿出来直接使用;

　　5. 细胞悬液加入冻存液后，避免在常温下长时间放置，因为DMSO常温下对细胞损伤大;分装完成后立即转入程序降温盒放到-80℃冰箱，不需要放4℃冰箱;

　　6. -80℃冻存过夜后，可以转入液氮长期保存;转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷，不要长时间在常温放置，避免冻存管融化;

　　7. 若没有液氮罐，存放在-80℃的时候，一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定;

　　8. 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见，可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存;

　　9. 若没有使用冻存盒，在转入液氮的过程中一定要对冻存管做好保冷措施，不能直接用手拿，可以用干冰或者少量液氮保护后转移，操作过程注意安全;

　　10. 转移过程要快，避免冻存管暴露于常温后融化。

　　细胞复苏：

　　1. 如果水浴锅与液氮罐未被放置于同一个房间，需要对冻存管进行保冷后，再转移到水浴锅旁，避免路途细胞表面融化;

　　2. 细胞溶解过程要快速摇晃以加速溶解;

　　3. 已溶解的冻存细胞避免长时间在常温存放，需尽快离心去除DMSO;

　　4. 贴壁细胞复苏24小时后观察，若密度达到80%，则正常传代;若密度不到80%，则继续培养到48小时再换液;

　　5. 悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液;

　　6. 对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心;减少操作步骤，也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内，补加新鲜培养基，放入温箱内培养。但培养12~24小时后，必须换新鲜的培养基，移除死细胞。

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