ELISA实验中：收集血清样本抗凝剂和促凝剂的使用方法
 

　　1.实验计划

　　① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。

　　② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面贴于同一张载片上，否则无可比性。

　　③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。

　　2.Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液)

　　(1)工作液：无须稀释

　　(2)原液：

　　① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。

　　如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验;

　　若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。

　　② 原液的保存(—20℃)冻存——应选稀度冻存。

　　③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存(-20 ℃)于 冰箱备用。

　　④ 关于Ab保存应参照说明书。

　　(3)Ab浓度的选择

　　Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少;极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。

　　3.Ab滴片技术

　　—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。

　　[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。

　　要领：甩净组织周围的水。

　　4.PBS洗涤技术

　　(1)洗涤的目的

　　① 保证离子浓度和PH值。

　　② 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯)

　　(2)方法：洗三次，每次5分钟。

　　5.Ab孵育技术

　　(1)必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。

　　(2)温度与时间 4℃：过夜;

　　37℃：2 h or 参考说明书

　　6.光镜控制显色方法

　　(1)室内操作：注意温度与时间的关系，室温zui宜5分钟。

　　(2)染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。

　　对照组和染色结果的评价

　　从以下几 个方面综合评价：

　　1.阳性染色特点

　　① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。(非特异性～细胞与组织无区别)

　　② 染色强度不同：颜色深浅不一(非特异性染色 弥散性均匀)

　　2.组织切片制作过程的影响

　　① 固定不良—非特异性染色，显示不均。

　　② 边缘干燥—非特异性染色(常见)，加抗体时勿干片。

　　3.人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。

　　阳性对照：

　　用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。

　　阴性对照：

　　用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照 还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。

　　▲ 染色失败的几种原因：

　　(1)所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部(-)原因可能：

　　① 染色未*严格按照操作步骤进行;

　　② 漏加一种抗体，或抗体失效;

　　③ 缓冲液内含*，抑制了酶的活性;

　　④ 底物中所加H2O2 量少或失效;

　　⑤ 复染或脱水剂使用不当

　　(2)所有切片均呈阳性反应，原因可能是：

　　① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。

　　② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不*。

　　③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。

　　④ 抗体温育的时间过长。

　　⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。

　　(3)所有切片背景过深，原因可能是：

　　① 未加酶消化处理切片。

　　② 切片或涂片过厚。

　　③ 漂洗不够。

　　④ 底物呈色反应过久。

　　⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

　　⑥ 使用全血清抗体稀释不够。

　　(4)阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

　　常见的原因是：标本的固定和处理不当。

　　ELISA试剂盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。

　　标签：血清 促凝剂 试剂盒 缓冲液 抗体 抗原 ELISA 试剂盒