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　　技术资料 | 实时荧光定量(qPCR)知识点分享

　　实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

　　qPCR 原理

　　将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

　　那在我们了解了qPCR的原理之后，我们接下来就要了解一下这几个我们在做实时荧光定量PCR的实验时，一定要清楚的知道的几个概念：CT值、扩增曲线、基线、荧光阈值和阈值循环数。

　　01、Ct 值的定义

　　在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

　　02、扩增曲线(amplification curve)

　　是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。

　　03、基线(baseline)

　　是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。

　　04、荧光阈值(threshold)

　　是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。

　　05、阈值循环数

　　表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小;起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。

　　06、荧光化学

　　目前，实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。现将其原理简述如下：

　　1)TaqMan荧光探针：

　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

　　探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

　　2)SYBR荧光染料：

　　在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

　　那我们要如何选择qPCR的检测方法呢?下面古朵生物技术小编就列出他们各自的优缺点，大家可以参考一下!

　　qPCR和常规PCR的区别

　　实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测

　　敏感性高

　　需要样品少

　　特异性高

　　精确定量

　　qPCR常见问题分析

　　1.无Ct值出现

　　检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

　　引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。

　　模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

　　模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

　　2. Ct值出现过晚(Ct>38)

　　扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。

　　PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

　　PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

　　3. 标准曲线线性关系不佳

　　加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

　　标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

　　引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

　　模板中存在抑制物，或模板浓度过高

　　4. 负对照有信号

　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

　　5. 扩增效率低

　　反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

　　反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

　　反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

　　6. 溶解曲线不止一个主峰

　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。

　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

　　7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断?

　　判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性

　　如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

　　8. 扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?

　　参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)

　　模板的浓度太高或者降解

　　荧光染料的降解

　　荧光定量PCR  上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。