古朵生物：琼脂糖的原理及实验过程实验原理
 

　　琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物，以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下，忽略DNA分子携带的电荷，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。

　　不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA。

　　核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子;聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在 N,N,N′-四甲基乙二/胺(TEMED)和过/硫酸/铵(AP)的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺(Bis)交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果很好，且分辨力好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大，带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 6V/cm。而对于大片段电泳，可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳，可使用聚丙烯酰胺凝胶。

　　核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉，但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以综合考虑，多采用 TBE 缓冲液。

　　核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(EB)。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性，现在大多选择EB替代品进行试验，比较常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整体效果都弱于传统的EB。

　　材料、试剂及器具

　　1、材料

　　合适的Marker(分子量标准);DNA 样品

　　2、试剂

　　加样缓冲液(6x或10x);琼脂糖;溴化乙锭(EB)。

　　3、器具

　　(1)电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。

　　(2)凝胶成像系统或紫外透射仪。

　　实验过程

　　1、按所分离的 DNA 分子的大小范围，选择合适的比例的凝胶，称取适量的琼脂粉，放到一锥形瓶中，加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。待胶液却至 60℃左右，在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。

　　2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

　　3、待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

　　4、在槽内加入TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。

　　5、把待检样品，按合适比例与加样缓冲液混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。

　　6、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节合适电压，稳压输出，开始电泳。

　　7、观察溴酚兰的带(蓝色)的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时，可停止电泳。

　　8、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯(360nm 或 254nm)，通过观察孔进行观察。

　　ELISA试剂盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求”的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量”的方针