怎么样正确的进行ELISA试剂盒的检测

 

　　规格：96T48T

　　用途：科研实验(仅供实验室研究使用)

　　保存：2-8℃。

　　有效期：6个月

　　结合物的制备

　　1.戊二q交联法

　　戊二q是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二q直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。

　　ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二q作用，透析除去多余的戊二q后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二q作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。

　　2.过ss盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过ss钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。

　　按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过*洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法尤为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。

　　结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高;结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的*高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。

　　结合物的保存

　　酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液(见3.2.5)临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠)，以防止细菌生长。

　　结合物的稀释液

　　用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%牛血清白蛋白)，通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。

　　试剂盒组成

　　标本要求

　　1.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

　　2.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步骤

　　1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

　　2.加样

　　分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

　　4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

　　5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　7.温育：操作同3。

　　8.洗涤：操作同5。

　　9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

　　10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

　　11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

　　操作程序总结：

　　计算

　　以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

　　注意事项

　　1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

　　2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

　　3.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

　　4.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

　　5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6.底物请避光保存。

　　7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

　　8.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

　　9.本试剂不同批号组分不得混用。

　　洗涤液

　　在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。

　　酶反应终止液

　　常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

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