Western Blot为何标记二抗而不是一抗?有什么区别？
 

　　如果一抗上直接加标记，不但不能保证抗体抗原反映的特异性，也不能保证实验的可重复性。

　　首先，由于抗体都是人工去设计的，对于一个人工设计的蛋白质来说，你可以设计一个很好的抗体与他结合;然而对于天然蛋白质，你不能保证一个很高的识别率和准确度。所以，针对1抗，我们可以设计出完美的2抗，然而针对原蛋白质，你无法设计一个特别完美的1抗。所以，直接标记1抗的出来的结果是不准确的，而标记2抗是相对于1抗直接标记来说更准确的，所以经过大量的实验之后人们抛弃了直接标1抗的方法。当然，标2抗也不是完全完美的，当然你也可以标3抗，4抗，不过那个成本就指数上升了，在保证一定的置信度的情况下，人们一般标到2抗就够了。

　　其次，对于同一个抗原，不同来源的1抗所识别的位置可能会有很大差异。这样，你就无法保证试验的可重复性。而1抗作为抗原来讲，可以将它的抗原决定簇设计的一样，这样针对不同的1抗，2抗是可以保证差不多一个样子的。而且这也给节约成本和方便标记带来了方便。

　　所以一般现在都是2步标记，第一个原因是主要的，第二个原因是次要的。

　　免疫印迹(Western Blot) 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜(NC)上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的 NC 膜就称为一个印迹(blot)，用蛋白溶液(如 5%BSA 或脱脂奶粉溶液)处理，封闭 NC 膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体(一抗)处理 NC 膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的 NC 膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

　　wb一抗和二抗的区别：

　　1、二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗。

　　2、检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

　　3、即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

　　4、能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。

　　5、【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。

　　6、这通常是针对单克隆抗体而言。

　　7、多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。

　　8、其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。

　　9、如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)，那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。

　　10、在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。

　　11、提供通用的IgG(H+L)二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM (mu) Antibody、IgA的Anti IgA (alpha-Antibody、IgE的Anti IgE (epsilon) Antibody等。

　　12、【二抗的种属来源】一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。

　　13、然而在一些特殊的实验里， 如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。

　　14、有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。

　　15、【二抗的耦联标记】一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物P，PAP)，荧光基团(FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等)、生物素、金颗粒。

　　16、选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。

　　17、对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗;而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。

　　18、如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。

　　19、在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记;而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。

　　20、提供上述所有不同类型标记的二抗。

　　21、【是否经过血清吸附过的二抗】为减少二抗与样本的非特异性结合，能为您提供不同血清吸附的原装进口二抗。

　　22、如您的检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果您对实验的特异性要求很高，那我们向您推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织(如IgG等)可能发生非特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最低。

　　23、【Anti-IgG还是Anti-IgG, F(ab’)2 fragment】在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG, F(ab’)2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。

　　24、常规的Anti-IgG (H+L)二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即与IgG的Fc的F(ab’)2片段都能结合;由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG (H+L)与它们都有交叉反应。

　　25、而Anti-IgG, F(ab’)2 fragment经过了IgG Fc片段的吸附，因此只与IgG的F(ab’)2片段结合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此与它们也有交叉反应。

　　26、【Anti-IgG(H+L)、Anti-IgG (gamma)、Anti-IgM (mu)、Anti-IgA (alpha)】在一些特殊的实验里，只需要检测样本里的IgG或者IgM，常规的Anti-IgG (H+L)由于与IgG的重链和轻链都有结合反应，而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此不能特异性的检测某种类型的IgG或者IgM。

　　27、这时候就需要针对特殊类型Ig分子的二抗。

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