热点快讯| 细胞免疫荧光实验原理及其步骤
 

　　实验原理

　　细胞免疫化学与免疫组织化学实验都是依据抗原抗体反应和化学显色的原理，采用标记的特异性抗体对组织或细胞内抗原的分布进行原位检测技术。细胞免疫化学将培养处理后的细胞爬片、固定、破膜、封闭后，加入一抗与抗原蛋白结合，再加入标记有荧光素的二抗与一抗进行反应，最后通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光拍摄来显示细胞中靶蛋白的表达变化和定位。

　　1，取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心。

　　2，4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

　　3，0.2%Triton X 100通透10分钟，PBS洗三遍。

　　4， 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

　　5.，一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

　　6，二抗室温2小时，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

　　7，最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

　　8，蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。

　　技术应用

　　检测靶蛋白如内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物。

　　三、实验问题

　　1、荧光信号背景很高?

　　a、一抗质量不佳

　　b、选用特异性和效价更高的抗体。

　　c、抗体浓度太高

　　d、注意调整一抗和二抗的稀释比例。

　　e、封闭不完全

　　f、改善封闭条件。

　　g、洗涤不充分

　　2、荧光信号较弱?

　　a、目的蛋白表达量过低

　　b、可以设置表达量较高的阳性细胞作为对照。

　　c、细胞破膜效果不佳

　　d、采用合适的通透剂或采用甲醇固定无需通透。

　　e、一抗稀释度过大

　　f、需进行预实验摸索一抗稀释比例。

　　g、二抗选择错误

　　h、使用能正确识别一抗的二抗。

　　四、常见问题FQA

　　Q：哪些荧光染料常用于细胞免疫荧光检测?

　　1、异硫氰酸(Fluorescein lsothiocyanate, FITC)

　　490～495nm

　　520～530nm,呈翠lv色荧光

　　2、四甲基异硫氰酸罗丹明(Tetramethyl Rhodamine lsothiocyanate, TRITC)

　　620nm,橙红色荧光

　　3、四乙基罗丹明(RB200)

　　595～600nm，呈橙红色荧光

　　4、德克萨斯红(Texas Red)

　　620nm，红色荧光

　　5、CY3

　　568-574nm，呈鲜红色荧光

　　6、碘化丙啶(Propidium lodide, PI)

　　630nm，呈红色荧光

　　7、4’ ,6-e二脒基-2-苯基吲哚(4‘ ，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)

　　461nm，蓝色荧光

　　Q：怎样选择二抗标记的荧光?

　　A: 二抗标记的荧光颜色的选择非常重要，要求在实验前根据现有材料和仪器的局限性设计好实验方案，一般我们进行三种颜色的标记工作。目前细胞核染料常用PI(红色)或DAPI(蓝色)，如果细胞中还表达EGFP(绿色)，则需要选用其他颜色的荧光素来标记目的蛋白，不得已的情况下采用颜色相近，后期也要用光谱拆分技术对图片进行处理(需专业人员进行，不建议采用相近颜色)。

　　Q：怎样选择细胞免疫化学爬片所用的固定剂?

　　用甲醇，强烈脱水变性蛋白，并可溶解脂类物质产生通透效应;蛋白变性完全，对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原，无需通透处理不易保存细胞形态，细胞可能呈扁平状。

　　细胞结构抗原、酶类抗原交联剂用多聚甲醛，导致细胞内分子相互连接呈网状结构，并维持在原位上，更易于保持细胞的结构交联产生的阻碍可能会降低细胞组分的抗原性，需要通透处理细胞膜相关组分蛋白。

　　Q：做细胞免疫荧光大概提供多少抗体合适?

　　A：细胞免疫荧光实验我们需先进行预实验采用普通荧光显微镜进行观察，确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。24孔板的细胞爬片在进行一抗37℃孵育时，一般加入200ul经BSA稀释的一抗，其稀释倍数需参考抗体说明书，如稀释倍数为1：100则每张爬片需要2ul(进行细胞免疫荧光的一抗稀释倍数要比WB的小)。注意提供的抗体量需满足预实验和正式实验所需的量。

　　Q：激光共聚胶显微镜拍摄除用于细胞免疫荧光拍摄外还可以进行哪些检测?

　　A：由于各种荧光标记探针的应用，通过对荧光探针分布和荧光强度的分析，Confocal实验还可以用于进行细胞内游离钙、线粒体膜电位、活性氧、细胞膜流动性、细胞结构等实验结果的拍摄和分析工作。根据客户对细胞处理的要求并且购买合适的探针试剂盒，我们也可以为您进行您实验所需的Confocal拍摄工作。

　　五、三种细胞免疫荧光染色的实验步骤

　　A、zo-1的免疫荧光，步骤如下：

　　1. 细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

　　2. 用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟。

　　3. 4%的甲醛室温固定20-30分钟。

　　4. 1×PBS洗3次，每次10分钟。

　　5. 0.2%Triton X-100透化2-5分钟。

　　6. 1×PBS洗3次，每次10分钟。

　　7. 5%BSA室温封闭30分钟。

　　8. 加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜。

　　9. 1×PBS洗3次，每次10分钟。

　　10. 加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光。

　　11. 1×PBS洗3次，每次10分钟。

　　12. 95%甘油封片。

　　注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释。

　　B、细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：

　　1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

　　注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

　　2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

　　3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

　　4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

　　5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

　　6. 二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

　　7. 最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

　　8. 蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

　　建议：

　　1. 还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。

　　2. 荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。

　　3. 二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

　　C、细胞免疫荧光简单实验步骤如下：

　　1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。

　　2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。

　　3. PBS洗净：3min×3。

　　4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。

　　5. PBS洗净：2×5 min。

　　6. 羊血清封闭：37度，20分钟。

　　7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。

　　8. 4度PBS洗净，3 min×5次。

　　9. 二抗37度小于一小时。

　　10. 37度 PBS洗净，3×5 min。

　　11. 凉干封片(封闭液PH8.5)

　　不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时。

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