古朵知识分享：石蜡切片免疫组化染色常见问题相关知识
 

　　内源性生物素：生物素是一种维生素，作为一种辅酶参与羧化反应。在人体组织中，绝大多数生物s与线粒体丙酮酸盐羧化酶相关，因此，富含线粒体的细胞具有丰富的内源性生物素，如肾脏、肝脏以及一些肿瘤细胞。如果应用生物素/卵白素检测系统，由于卵白素可以和生物素不可逆地强结合，势必会造成非特异性染色，热介导的抗原修复可以显著“复活”内源性生物素，所以更加加剧这种非特异背景染色。解决的方法除了换成非生物素的检测系统外，还可以用以下简单的方法封闭内源性生物素。

　　首先用蛋清中的卵白素(一个鸡蛋清加入到100ml的PBS中)封闭内源性生物素，再用5%奶粉作为生物素替代品(5克奶粉加入100ml的PBS/TBS中)来封闭卵白素中未结合的位点，冲洗后即可加一抗。内源性过氧化物酶天酒地 一般红细胞和嗜中性粒细胞中过氧化物酶含量比较高，会造成非特异性染色。灭活内源性过氧化物酶的方法：0.3%-3%H2O2，用PBS(pH7.4)或蒸馏水或甲醇配制。冲洗步骤免疫组化染色步骤中包括多次冲洗过程，任何一步出现冲洗不干净的问题，都有可能产生背景染色。解决的方法可以在冲洗液中加入吐温20，一般在1000ml的冲洗液中加入0.2ml的吐温20即可。鼠单抗用于鼠组织由于小鼠组织中可能含有内源性IgG，所以检测系统就会识别这些抗体，造成非特异性染色。解决的方法要么封闭内源性IgG，要么直接使用商品化的Mouse-to-Mouse检测试剂盒。固定不及时

　　可以造成蛋白弥散，会产生异位染色。干片孵育的过程中没有放入湿盒或加入液体过少或孵育时间过长，都会造成局部(尤其是边缘)干片，应该避免。修复过度抗原热修复(尤其是使用EDTA)有时会造成细胞核异位染色，对于细胞核染色的抗体这种情况应通过对。

　　免疫组化常见问题分析

　　1、石蜡切片在染色过程中出现脱片现象

　　烤片时间不够，或温度不够，科研延长烤片时间和提高烤片温度;

　　用含有多聚赖氨酸的拨片，可以购买到或这自己做;

　　有些组织本身就容易掉片，如骨组织登，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织;

　　用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

　　2、边缘效应

　　组织边缘与拨片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致.解决办法：制备优质的胶片(APES或多聚赖氨酸)，切除尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织;

　　切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

　　3、产生组织切片非特异性染色

　　抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条;

　　一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看;

　　内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色;

　　非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果;

　　DAB孵育时间过长或浓度过高;

　　PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要;

　　标本染色过长中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

　　4、免疫组化染色呈阴性结果

　　抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误;

　　抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4次*6min试试;有人做过实验，这是最佳的时间和次数;若不行，还可高压修复;

　　组织切片本身这种抗原含量低;

　　血清封闭时间过长;

　　DAB孵育时间过短;

　　细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应;

　　开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

　　5、背景

　　考虑一抗浓度高;

　　然后调整DAB孵育时间;

　　也要考虑血清封闭的时间是否过短;

　　适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

　　石蜡切片免疫组化试剂 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。