技术分享——免疫沉淀技术分类与影响因素
 

　　随着对蛋白质研究的不断深入，人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合，在其基础上衍生出很多更为复杂的技术，使蛋白质分析方法更为多样化，应用范围更为广泛。该技术现已广泛应用于基因、蛋白质以其相互作用等研究领域。按应用范围分类，可分为以下四类：

　　1、免疫沉淀(Individual protein immunoprecipitation, IP)：利用抗体特异性从细胞裂解物或其他可溶性生物样品中纯化已知特定蛋白质。IP与SDS-PAGE方法联用时，可达到测量蛋白质相对分子量，对已知抗原定量，确定蛋白质降解速率等目的。

　　2、免疫共沉淀(Protein complex immunoprecipitation , Co-IP)：利用抗体沉淀相应特定抗原，同时沉淀与该抗原相互结合的其他分子，主要用于研究蛋白质相互作用。Co-IP与WB或质谱方法结合，可用于确定特定蛋白-兴趣蛋白在天然状态下的结合情况，确定特定蛋白质的新作用搭档。

　　3、染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)：在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断，通过免疫沉淀复合体特异性富集目的蛋白结合的DNA片段，再通过对DNA片段的纯化和检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可用于研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达间的关系。将ChIP与基因芯片相结合形成的ChIP-on-chip方法，可用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合，可用于寻找反式因子的体内结合位点。

　　4、RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)：其原理与ChIP相近，但RNA免疫沉淀是用来研究与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用。

　　RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等)。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化

　　

 

　　免疫沉淀的关键影响因素

　　每种免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序，但都是以抗原-抗体特异性结合为基础。目前常规操作是利用共价结合蛋白A或蛋白G的琼脂糖或磁性微球将反应后的抗原-抗体复合物富集纯化。蛋白A和蛋白G能特异地和抗体的保守区Fc段结合，形成稳定的抗原-抗体复合物附着在微球上，溶液内无关的分子可以通过洗涤微球被清除，最后，再采用一系列方法分析纯化抗原或与抗原结合的其他分子。整个过程中值得注意的几个关键影响因素如下：

　　1、样品处理的质量

　　免疫沉淀实验成功的关键在于第一步样品处理。免疫沉淀实验本质是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中抗原的质量，如抗原的丰度及抗原的构象状态。

　　样品处理应根据抗原样品的来源如组织样品、细胞或其他形式的样品，选择适当的方式进行细胞或组织破碎，使待检抗原释放至样品溶液中。裂解缓冲液的使用应注意添加合适的蛋白酶抑制，避免抗原或抗原-其他分子复合物被降解，另外，应选用去垢剂强度合适的裂解液，既保证有效裂解细胞释放抗原又不破坏蛋白质之间的相互作用。

　　2、抗体的选择

　　在考虑抗体特异性的同时，还需考虑抗体对抗原的亲和力，如单克隆抗体只对抗原的单一表位具有良好的特异性，因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分，受到破坏，或受其他因素影响，造成抗体不能识别抗原，无法有效形成免疫沉淀复合物，那么这将直接影响免疫沉淀的结果。而多克隆抗体或混合单克隆抗体可以和抗原的多个表位结合，从而解决亲和力的问题。但是，并不是所有抗体都能用于免疫沉淀，应选用经IP实验验证后的抗体以确保实验结果的可靠性。此外，不同类型、同类不同亚型的抗体对蛋白 A或G的亲和力不同，应选择合适的抗体及微球用于免疫沉淀。

　　3、微球的选择

　　目前广泛应用于免疫沉淀的微球以结合了蛋白 A或G的琼脂糖和磁性微球为主。琼脂糖材料是无色透明、粒径达微米级的具有多孔表面的微球，有巨大的表面积，蛋白结合量高，曾一度成为免疫沉淀技术中的主要材料。但在免疫沉淀操作中需要采用离心的方法达到固液分离，而反复离心产生的物理应力极易破坏蛋白的天然构象及完整性，且由于琼脂糖本身容易破碎，不易保存，限制了琼脂糖微球在免疫沉淀中的发展。相比之下，磁性微球其核心为超顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子材料，表面平滑，粒径可达纳米级，比表面积大，单位重量的微球蛋白结合量更大。超顺磁性微球可以在外加磁场中表现磁性，实现快速有效分离，大大缩短实验操作时间。温和的磁性分离方式避免反复离心对蛋白天然构象及完整性的破坏。超顺磁性微球在增大机械强度和稳定性的同时，缩减了产品造价。上述的优势使超顺磁性微球成为免疫沉淀试剂盒行业的新秀，逐渐被研究者所采用。

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