AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒技术资料

　　AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒技术资料

　　组织AMPK 激酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到AMPK 磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生 ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应，即采用比色法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析组织裂解样品中 AMPK 活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中 AMPK 激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

　　技术背景

　　5’AMP活化蛋白激酶(5’AMP activated protein kinase;AMPK)属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物，由3个亚体，α、β、γ构成：其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶(cystathione beta synthase;CBS)结构域，又称为巴特曼(Bateman)结构域，以探测AMP和ATP的比例;α亚体含有催化结构域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 复合物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2 和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定：促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄糖吸收和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高度表达。其磷酸化目标序列为 LKKLTRASFFGQ。基于底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽， 进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD)，其峰值的变化(340nm)，来定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反应方式为：

　　产品内容

　　清理液(Reagent A)毫升

　　裂解液(Reagent B)毫升

　　缓冲液(Reagent C)毫升

　　酶促液(Reagent D)微升

　　反应液(Reagent E)微升

　　底物液(Reagent F)微升

　　阴性液(Reagent G)微升

　　产品说明书1 份

　　保存方式

　　保存 清理液(Reagent A)在 4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融;有效保证 6 月

　　用户自备

　　AMPK 激酶：用于抑制剂筛选

　　1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器

　　15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

　　(微型)台式离心机：用于细胞预处理

　　比色皿或酶标板：用于比色分析操作的容器分光光度仪或酶标仪：用于样品比色分析

　　实验步骤

　　一、 待测样品准备

　　1. 手术取出动物组织，并秤重 500 毫克组织重量

　　2. (选择步骤)放进预冷的 15 毫升锥形离心管

　　3. (选择步骤)加入毫升 清理液(Reagent A)清洗

　　4. (选择步骤)抽去清理液

　　5. 移入到一个液氮冻存管

　　6. 即刻放进液氮罐过夜

　　7. 次日从液氮罐里取出，即刻(最快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意：切莫使组织冻融)

　　8. 放进一个 15 毫升锥形离心管

　　9. 加入置于冰槽里的微升 裂解液(Reagent B) 10.强力涡旋震荡 30 秒，充分混匀

　　11. 放进冰槽里孵育 30 分钟，期间每 10 分钟强力涡旋震荡 30 秒(注意：如需暂时停止，放进-70℃冰箱里储存备用)

　　12. 即刻放进 4℃台式离心机离心 10 分钟，速度为 10000g

　　13. 小心移取上清液到新的无菌的 1.5 毫升离心管

　　14. 移取 10 微升进行蛋白定量检测(注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-

　　GMS30030.1)

　　15. 放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

　　二、 测定准备

　　1. 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等)，置于冰槽里

　　2. 设定好分光光度仪(温度为 30℃)：波长为 340nm，间隔 1 分钟，读数 6 次(共 5 分钟)，并置零三、 背景对照测定

　　1. 移取微升 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

　　2. 加入微升 酶促液(Reagent D)

　　3. 加入微升 阴性液(Reagent G)

　　4. 放进 30℃培养箱里静置 2 分钟

　　5. (选择步骤)放进分光光度仪，置零

　　6. (选择步骤)取出比色皿

　　7. 加入微升 反应液(Reagent E)

　　8. 加入微升 底物液(Reagent F)

　　9. 上下倾倒数次，混匀(限定在3 秒之内) 10.即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 5 分钟

　　四、 样品测定

　　1. 移取微升 缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

　　2. 加入微升 酶促液(Reagent D)

　　3. 加入 5 微升待测样品(注意：50 微克细胞裂解悬液蛋白;样品须溶解)

　　4. 放进 30℃培养箱里静置 2 分钟

　　5. (选择步骤)放进分光光度仪，置零

　　6. (选择步骤)取出比色皿

　　7. 加入微升 反应液(Reagent E)

　　8. 加入升 底物液(Reagent F)

　　9. 上下倾倒数次，混匀(限定在3 秒之内)

　　10.即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数：340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 5 分钟

　　五、 计算样品活性

　　单位=微摩尔 NADH/分钟

　　六、酶标板测定

　　1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品

　　2. 分别移取微升 缓冲液(Reagent C)到 96 孔板中

　　3. 分别加入微升 酶促液(Reagent D)

　　4. 分别加入 5 微升 阴性液(Reagent G)或待测样品(50 微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意：样品须清澈)

　　5. 轻轻摇动 96 孔酶标板

　　6. 在 30℃温度下孵育 2 分钟

　　7. 分别加入微升 反应液(Reagent E)

　　8. 分别加入微升 底物液(Reagent F)

　　9. 轻轻摇动酶标板

　　10. 即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数

　　11. 活性计算：

　　单位=微摩尔 NADH/分钟

　　七、抑制剂筛选

　　1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品

　　2. 按下表加入试剂

　　内容物样本背景完全酶活性待测抑制剂酶活性

　　缓冲液

　　(Reagent C)微升微升微升

　　阴性液

　　(Reagent G)微升————

　　待测抑制剂微升――微升

　　用户自备的纯化酶——微升(1 毫单位)微升(1 毫单位)

　　96 孔板每孔总量样本背景孔

　　( 微升)完全活性孔

　　( 微升)待测抑制剂样品孔

　　( 微升)

　　3. 轻轻摇动酶标板，混匀

　　4. 放进 30℃培养箱里静置 30 分钟

　　5. 分别加入微升 酶促液(Reagent D)

　　6. 分别加入微升 反应液(Reagent E)

　　7. 分别加入微升 底物液(Reagent F)

　　8. 轻轻摇动酶标板

　　9. 即刻放进酶标仪检测：获得初始吸光读数(OD) 10.放进 30℃培养箱里孵育 30 分钟11.即刻放进酶标仪检测：获得终点吸光读数(OD)

　　12.实际吸光读数：初始吸光读数(OD)—终点吸光读数(OD)

　　13.抑制活性计算：

　　2)IC50：50%抑制率所需的抑制剂浓度

　　3) 直接构建抑制曲线：纵座标(Y 轴)为吸光读数 OD;横座标(X 轴)为已知抑制剂浓度

　　注意事项

　　1. 本产品为 25 次操作，包括背景操作

　　2. 操作时，须戴手套

　　3. 系统操作过程中，背景测定只需 1 次

　　4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

　　5. 样品须澄清，至关重要

　　6. 加入 底物液(Reagent F)后 3 秒内即刻比色测定

　　7. 测定值由高到低变化;测定可持续 30 分钟

　　8. 比色测定后，比色皿须清洗彻底

　　9. 样本测定 0 分钟读数高于 5 分钟读数表明具有酶活性

　　10. 建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/5 微升(本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1)

　　11. 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

　　12. 可以使用 AMPK 抑制剂(DORSOMORPHIN)作为抑制剂对照或阴性对照

　　13.5’AMP 活化蛋白激酶活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位

　　14.本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

　　质量标准

　　1. 本产品经鉴定性能稳定

　　2. 本产品经鉴定检测敏感

　　AMPK激酶活性比色法定量检测试剂盒技术资料 古朵既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。产品涵盖有机试剂、无机试剂和生 化试剂，标准物质、天然植物提取物及中药标准品，核酸、酶、缓冲剂、显色底物，医药中间体、原料药、催化剂、高纯溶剂、特种高分子材料及实验室常用耗材。 品种类超过2万种，广泛应用于细胞药理、药剂、分子生物学等科研领域。