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古朵生物:染色质免疫沉淀中的对照与抗体选择

发布时间:2018-08-29 16:03 点击次数:

Input对照:

在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联,DNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率,所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。

Beads选择:

接下来,利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物,然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物,特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤,除去非特异结合的染色质后,用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magna beads是近年来出现的一种新型beads,它使用方便,不像Agarose beads那样容易破裂,所以在操作过程中更简单,而且免去了离心的步骤,节省不少时间。

抗体选择:

染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的,只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。

阳性与阴性对照:

在做ChIP实验时,一定要做好实验对照,因为没有对照,很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能,所以通常还会选择一对阴性引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀(Immunoprecipitation)检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验的检测。

交联反应的逆转和DNA的纯化

用不含DNase的RNase和Proteinase K,65 °C保温6小时逆转交联,经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。DNA纯化柱纯化DNA的质量高,有利于下一步PCR等方法的检测。因为甲醛不仅交联DNA-蛋白质,还交联蛋白质-蛋白质,所以还可以对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K,然后用丙酮回收有机相中的蛋白质,进行分析。

DNA的鉴定

最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点,所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同。而且启动子区域多富含CG的序列,其PCR条件可能需要相应调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果(图1)。

免疫沉淀技术的原理和抗体选择


ChIP技术的应用

染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的,可采用狭缝杂交(Slot blot)的方法,把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交,来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。还可以根据靶序列设计引物,用半定量PCR的方法进行测定,或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput),可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少,所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针,再进行整个基因组扫描。还可以把沉淀的DNA克隆到载体中,进行测序,寻找该序列附近的开放阅读框,发现新的基因调节序列。

目前,随着人类基因组测序工作的基本完成,研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大,上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片(chip)技术与染色质免疫沉淀技术(ChIP)相结合,为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段,和另一个被标记不同探针的对照组样品一起,与DNA芯片杂交,再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析,具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络染色质修饰机制在基因组中的调控,DNA的复制,修复以及修饰,基因的转录与核运输等诸多方面。

染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列,即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。

近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用,其原理与DNA类似,也包括甲醛固定,超声波破细胞,免疫沉淀,交联逆转,RNA纯化和RNA鉴定等步骤。所不同的是,交联逆转只用Proteinase K,要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理,分析时用RT-PCR,芯片杂交要用cDNA芯片等。

随着免疫沉淀技术的优点越来越广受关注,如何改进染色免疫沉淀技术中的操作也越来越被科研人员所重视。