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古朵生物浅谈:氨基酸的离子交换柱色谱分离

发布时间:2018-08-29 15:57 点击次数:

【原 理】
本实验采用磺酸型阳子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下,因为低于Lys的pI值,Lys可解离成阳离子挂在树脂上;高于Asp的pI值,则Asp可解离为阴离子,不能被树脂吸附而直接流出色谱柱,在pH 12条件下,因高于Lys的pI值,Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来,这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操 作】
1、树脂的处理
关于市售新树脂的处理见注1,关于树脂浮洗的方法参照讲义所述,本实验采用处理好的树脂。
2、装柱:将色谱柱垂直装好,关闭柱底出口,在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中,加进1~2倍体积的柠檬酸缓冲液,经抽气处理后,搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满,倒时不要太快,以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2~3cm高时,用吸管吸去柱内上层所出现的清液,慢慢打开柱底出口,继续加注树脂悬液,直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败,另外树脂悬液的温度要相对恒定(特别是对于采用高温法)。装好的柱体应该没有纹路,没有裂痕,没有气泡和柱顶表面平整而均匀,这样方可投入使用,否则要重装。
3、平衡:柱装好后接上预先调好的恒流泵,用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡,直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止(pH试纸检查),这大约需要2~3倍床体积。
4、加样与洗脱:移去柱上的液器塞,打开柱底出口,小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中,加样时不要过快,以免冲坏树脂表面,加样后慢慢打开柱底阀,使液面再与树脂面相齐时关闭,然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1~2次。洗涤后,用缓冲液在柱内加到约2cm高的液层,然后接上恒流泵,调流速0.5ml/分即开始洗脱。
注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡,并且在调节时不要过猛,以免影响色谱行为。
5、收集:柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。
6、改换高pH洗脱收集:关闭恒流泵及柱底阀,将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液,然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。
7、测定:(注2)将收集的各管编号后,分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中,加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液,0.5ml茚三酮试剂,混合后在100℃水浴上加热25分钟。然后水冷却5~10分钟,加3m160%乙醇衡稀释,摇匀后用721型分光光度计 在570nm处比色。测定后,以光密度为纵坐标,收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。
8、再生,对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱,再用蒸馏水洗至中性后重复使用。
注:1、对于市售的干树脂其处理方法为:先经水充分溶胀后,倾去上面的泥状细粒,反复洗几次直到水澄清为止,然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂,浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗,每次半小时,换酸或碱时用水先将树脂洗至中性,最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型(对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定),在蒸馏水洗至中性备用。
2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右,这样在本实验中,改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。
【器 材】
①玻璃色谱柱:长19cm,内径1.2cm,3#砂芯。
②恒流泵(微量输液器)。
③Bs-160型部分收集器或以收度试管手工操作。
④721型分光光度计。
⑤刻度吸管、试管。
⑥水浴锅。
【试 剂】
①树脂:磺酸型阳离子交换树脂(732型)
②洗脱液:0.45mol/L、pH5.3柠檬酸缓冲液,取285克柠檬酸(C6O7H8·H2O);186克97%NaOH;105ml浓盐酸溶于水稀释至10升。
0.01mol/L pH12NaOH缓冲液,取4克NaOH溶于10升蒸馏水。
③样品液:0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。
④显色剂
三氯化钛——茚三酮溶液:
醋酸缓冲液:水150ml,无水醋酸钠82克,无水醋酸25ml,加水定容250ml pH5.5。
乙二醇甲醚750ml,加入茚三酮20克,三氯化钛(TiCl315%)1.7ml,用醋酸缓冲液定容到1升。