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古朵生物阐述:质粒 DNA 提取实验

人阅读 发布时间:2017-05-05 10:47


质粒 DNA 提取可以:(1)快速纯化质粒;(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

一、实验方法

1. 碱解法:

(1)实验方法原理:质粒多为一些双链、环状的 DNA 分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时最主要的 DNA 载体。
 
(2)提取质粒的基本步骤分为三步:
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒 DNA 的纯化

2. SDS 碱裂解法(试剂盒提取):


(1)实验方法原理:碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法,碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 值高达 12.6 的碱性条件下,染色体 DNA 的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以 pH 4.8 的 NaAc/KAc 高盐缓冲液去调节其 pH 值至中性时,变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
 
(2)简明原理:碱裂解法是基于 DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒 DNA 变性,再将 pH 值调至中性使其复性,复性的为质粒 DNA,而染色体 DNA 不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。

二、技术详解

质粒 dna 的提取是 DNA 技术中的必备实验技能。质粒 DNA 上携带的基因信息可经过基因表达实验后表现出相应的性状。质粒 DNA 的分离提取包括了培养细胞——收集——分离纯化三大步骤。

质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA,是进行 DNA 重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外,质粒 dna 上携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA 重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒 DNA,是 DNA 重组技术中最基础的实验技能。分离质粒 DNA 有三个步骤:
(1)培养细菌使质粒扩增
(2)收集和裂解细菌
(3)分离和纯化质粒 DNA

碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高,适合于大多数的和菌株,所得产物经纯化后可满足多数的 DNA 重组操作。此法采取酸碱度高达 PH 12.6 的碱溶液使 DNA 发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同,变性时前者虽然两条链分离,但仍然缠绕在一起不分开; 而后者完全变性分,甚至出现断裂。因此,当加入中和液时,溶液 PH 值恢复较低的近中性水平,此时, 质粒的两条小分子单链可迅速复性,恢复双链结构,但是主染色体 DNA 则无法复性。在离心时,大部分主染色体与细胞碎片,杂质等缠绕一起被沉淀,而可溶性的质粒 DNA 留在上清夜中。

在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒 DNA 链发生断裂。所以,多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:
共价闭合环状 DNA(cccDNA): 质粒的两条链没有断裂;超螺旋
开环 DNA(ocDNA): 质粒的一条链断裂;松弛的环状分子
线形 DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;线性分子


质粒DNA提取

三、材料、试剂及器具

1. 材料

E.coliDH 5α(pUC 19 vector)

2. 试剂

(1)LB 培养基

(2)TE 缓冲液

(3)裂解液:溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ

(4)酚:lvfang:异戊醇(25:24:1)

(5)无水乙醇

(6)70% 乙醇

(7)氨苄青霉素 50 mg/mL

3. 器具

离心机、离心管、吸嘴

四、操作步骤

以 1% 比例把 E.coliDH5α(含 PUC18)接种于含氨苄青霉素(Amp 100 μg/ml)的 LB 培养基中 37 ℃ 振摇过夜(12~18 h)



取 1.5 ml 培养物置离心管中



10 000 rpm,离心 1 min,或 4 000 rpm,离心 5~10 min



去上清,倒扣干净吸收纸上吸干



沉淀 + 100 μL 溶液Ⅰ



加或不加入少量溶菌酶粉末;混匀,室温放置 10 min



+ 加 200 μL 溶液Ⅱ(新鲜配置)



温和颠倒数次,混匀,冰上放置 5 min



+ 150 μl 溶液Ⅲ → 颠倒混匀,冰上放置 15 min



离心12 000 rpm,15 min



上清液+等体积酚:lvfang:异戊醇振匀,12 000 rpm,离心 5 min



小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质



上清液 + 2 倍体积无水乙醇混匀,室温 5 min~10 min



12 000 rpm,5 min~15 min

↓弃上清

沉淀 + 1 mL 70% 乙醇



12 000 rpm 离心 5 min~15 min



弃上清;并倒扣离心管使液体流干

↓+

自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜)



加 50 μl TE 缓冲液(20 μg/ml RNaseA)溶解质粒粗取物



-20 ℃ 保存

五、实验报告

检查、保存提取的质粒,要求记录实验现象并说明原因。

六、注意事项

1.  Buffer S2、Buffer S3 和 Buffer W1 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

2.  本试剂盒为 AxyPrep 质粒 DNA 小量试剂盒,适合于从 1~4 ml 细菌培养物中提取多至 20 μg 高纯的质粒 DNA。


注意:以上技术资料仅参考!

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