本试剂仅供研究使用

    目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中转化生长因子（PAF）的含量。

    实验原理：

    本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人血小板活化因子（PAF）水平。用纯化的转化生长因子（PAF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入转化生长因子（PAF），再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的转化生长因子（PAF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人血小板活化因子（PAF）浓度。

    试剂盒内容及其配制 ：

    试剂盒成份96孔配置48孔配置

    96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）

    塑料膜板盖1块半块

    标准品：100ng/ml  1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）

    空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）

    标准品稀释缓冲液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）

    生物素标记的抗OT抗体1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）

    亲和链酶素-HRP1瓶（12ml）1瓶（5ml）

    洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）

    底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

    底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

    终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

    试剂盒组成：

    试剂盒组成48孔配置96孔配置保存

    说明书1份1份

    封板膜2片（48）2片（96）

    密封袋1个1个

    酶标包被板1×481×962-8℃保存

    标准品：45μmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

    标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存

    酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存

    自备材料 ：

    1. 蒸馏水。

    2. 加样器：5ul、10ul 、 50ul 、 100ul 、 200ul 、500ul、1000ul。

    3. 振荡器及磁力搅拌器等。

    样品收集、处理及保存方法 ：

    1、血清……操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

    2、 血浆……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000 ×g离心30分钟去除颗粒。

    3、 细胞上清液……1000 ×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

    4、 组织匀浆……将组织加入适量生理盐水捣碎。1000 ×g离心10分钟，取上清液。

    5、 保存……如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

    血小板活化因子试剂盒操作注意事项：

    ●  试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

    ●  实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

    ●  不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

    ●  使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

    ●  使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

    ●  底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

    ●  加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

    ●  按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

    安全性 ：

    1.  避免直接接触终止液和底物A、B，一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

    2.  实难中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

    3.  不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

    试剂的准备 ：

    1.  标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：

    100

    ng/ml（6号标准品）原倍浓度不用稀释直接加入50ul

    50

    ng/ml（5号标准品）100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液

    25

    ng/ml（4号标准品）100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液

    12.5

    ng/ml（3号标准品）100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液

    6.25

    ng/ml（2号标准品）100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液

    3.12

    ng/ml（1号标准品）100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液

    0

    ng/ml（空白对照）原倍浓度不用稀释直接加入50ul

    2.  洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

    试剂盒性能 ：

    1.  灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

    2.  特异性：不与其它细胞因子反应。

    3.  重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

    人血小板活化因子ELISA检测试剂盒 操作步骤：

    1.  使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

    2.  根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

    3.  加入稀释好后的标准品50ul 于反应孔、加入待测样品 50 ul 于反应孔内。立即加入 50 ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

    4.  甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

    5.  每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

    6.  甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

    7.  每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

    8.  取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

    9.  在450nm波长处测定各孔的OD值。

    结果判断与分析 ：

    1、 仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

    2、 以吸光度OD值为纵坐标（ Y ），相应的 OT 标准品浓度为横坐标（ X ），做得相应的曲线，样品的 OT 含量可根据其OD 值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

    3、 检测值范围：0-100ng/ml

    4、 敏感度：0.39ng/ml