染色质免疫共沉淀技术（ChIP）] 实验原理 基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的 蛋白结合的 DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用，还可 以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP 与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CH [ChIP 染色质 免疫共沉淀 细胞 蛋白质 抗体]

实验原理

基 本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋 白结合的 DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。CHIP 不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用，还可以 用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP 与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP 与基因芯片相结合建立的 CHIP-on- chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究 RNA 在基因表达调控中的作用。由此可见，随着 CHIP 的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

实验试剂

1. 37% 甲醛
2. 甘氨酸
3. PBS
4. 蛋白酶抑制剂 （protease inhibitor）
5. RnaseA
6. 0.5MEDTA
7. 1MTris.HCl（PH6.5）
8. 10 mg/ml 蛋白酶 K 等。

实验设备

1. 10 cm 平皿
2. 水浴锅
3. 细胞刮刀
4. 超声破碎仪
5. 15 ml 离心管
6. 高速离心机
7. 交联仪等。

实验材料

培养好的细胞

实验步骤

1. 细胞的甲醛交联与超声破碎 （第一天）
1） 取出 1 平皿细胞（10 cm 平皿），加入 243 ul 37% 甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%（培养基共有 9 ml）。
2） 37 摄氏度孵育 10 min.
3） 终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125M.450 ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5 min 即可。
4） 吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。
5） 细胞刮刀收集细胞于 15 ml 离心管中（PBS 依次为 5 ml,3 ml 和 3 ml）。预冷后 2000rpm 5 min 收集细胞。
6） 倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer.使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 个细胞。这样每 100ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂 （protease inhibitor） 复合物。假设 MCF7 长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%.即为 4×106 个细胞。因此每管加入 400ul  Lysis Buffer.将 2 管混在一起，共 800ul.
7） 超声破碎：VCX750,25% 功率，4.5S 冲击，9S 间隙。共 14 次。

2. 除杂及抗体哺育 （第一天）
1） 超声破碎结束后，10,000 g 4 度离心 10 min.去除不溶物质。留取 300ul 做实验，其余保存于-80 度。300ul 中，100ul 加抗体做为实验组；100ul 不加抗体做为对照组；100ul 加入 4ul5MNaCl（NaCl 终浓度为 0.2M），65 度处理 3 h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
2） 在 100ul 的超声破碎产物中，加入 900ulChIPDilutionBuffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入 60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度颠转混匀 1 h.
3） 1 h 后，在 4 摄氏度静置 10 min 沉淀，700rpm 离心 1 min.
4） 取上清。各留取 20ul 做为 input.一管中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4 度颠转过夜。

3. 检验超声破碎的效果 （第一天）
取 100ul 超声破碎后产物，加入 4ul5MNaCl,65 度处理 2 h 解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

4. 免疫复合物的沉淀及清洗 （第二天）
1） 孵育过夜后，每管中加入 60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度颠转 2 h.
2） 4 度静置 10 min 后，700rpm 离心 1 min.除去上清。
3） 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4 度颠转 10 min,4 度静置 10 min 沉淀，700rpm 离心 1 min,除去上清。

洗涤溶液：
a. 低盐溶液一次
b. 高盐溶液一次
c. LiCl 溶液一次
d. TE buffer 两次
4） 清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共 1 ml。每管加入 250ul 洗脱 buffer,室温下颠转 15 min,静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管 500ul.
5） 解交联：每管中加入 20ul 5M NaCl（NaCl 终浓度为 0.2M）。混匀，65 度解交联过夜。

5. DNA 样品的回收 （第三天）
1） 解交联结束后，每管加入 1ulRNaseA（MBI），37 度孵育 1 h.
2） 每管加入 10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10 mg/ml 蛋白酶 K。45 度处理 2 h.
3） DNA 片段的回收-omega 胶回收试剂盒。最终的样品溶于 100ulddH2O.

6. PCR 分析 （第三天）

ChIP- chip 技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症 （cancer）、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。 研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前 ChIP-chip 技术研究主要集中于两个领域：及转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白 修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip 在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和 染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是，可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到 DNA 相互关系的简单影像；使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的 蛋白质的相关位点；直接或者间接（通过蛋白质与蛋白质的相互作用）的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难于获得；为 了获得高丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之，ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中 DNA 与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中，将对芯片的构建进行改进，提高其实用性。使用易于获得抗体，增加这种方法的可用性。