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酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法
人阅读 发布时间：2016-06-12 10:50
酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记 SPA 等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是 酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前， 高质量的酶（如辣根过氧化物酶，简称 HRP）国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
（一）酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶， 原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：
（1）来源方便，易于纯化；
（2）比活性高，性质稳定；
（3）酶活性和量能用简单方法测定。 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和硷性磷酸酶（AP），其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。由于辣根 过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋 白，糖含量 18% HRP 由多个同功酶组成，分子量为 40,000, 等电点为 PH3~9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶 溶于水和58% 以下饱和度硫酸铵溶液。HRP 的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275 nm，一般以 OD403nm /OD275 nm 的比值 RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶 RZ 值应在 3.0 左右（最高可达3.4）。RZ 值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变 性后，RZ值仍可不变。HRP 的催化反应需要底物过氧化氢（H2O2）和供氢体（DH2）。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料（D）。
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB（3.3-二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。 5AS（5-氨基水杨酸）早期曾用于 ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT（邻联甲苯胺）的特点是能产生鲜艳的蓝绿 色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD（邻苯二胺）和 TMB（四甲基联苯胺）。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者 比前者可高 4 倍以上。另外，还有一种供氢体称 ABTS[2, 2'-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）],其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS 与 TMB 皆是 值得被优选的供氢体。
由于 HRP 的底物 H2O2 本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的 H2O2 不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明 H2O2 已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
（二）HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种， 根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备 HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法
1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
2. 标记步骤：
（1）称取 HRP25 mg 溶于 1.25% 戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
（2）反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1 ml/1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于 5 ml,则以 PEG 浓缩至 5 ml。放置25 ml 小烧杯中，缓慢搅拌。
（3）将待标记的抗体 12.5 mg 用生理盐水稀释至 5 ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
（4）用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25 ml，继续搅拌 3 小时。
（5）加 0.2M 赖氨酸 0.25 ml，混匀后，置室温 2 小时。
（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4℃ 1 小时。
（7）3000 rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15 M PH7.4 的 PBS 中。
（8）将上述溶液装入透析袋中，对 0.15 M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10,000 rpm离心 30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3. 结果判定：
（1）定性及效价滴定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定 其活性。最后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（见本节（三）工作浓度的选择）。
（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定（光程 1 cm）。
酶量（mg/ml）=OD403nm×0.4
IgG 量（mg/ml）=OD280nm-OD403nm×0.42）×0.94×0.62酶量（mg/ml）IgG 量（mg/ml）酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 440,000 160,000 IgG量（3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2~4% 的酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
（1）0.1 M PH6.8磷酸缓冲盐水（PBS）：取0.2M Na2 HPO4 49 ml， 0.2M NaH2PO4 51 ml,NaCl 1.8 克，加蒸馏水至 200 ml。
（2）1.25% 戊二醛液：取 25% 戊二醛50 ml与PH6.8的PBS1 ml 混合。
（3）1M PH9.5 碳酸盐缓冲液：取 1M 碳酸钠3 ml 与 1M 碳酸氢钠7 ml 混合。
（4）0.2M 赖氨酸溶液：称赖氨酸 29.2 mg 溶于0.01M PH 9.5碳酸缓冲液 1 ml 中。
（5）0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。
（6）PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
（7）萘氏试剂及聚乙二醇（PEG,MW2000）。
（8）纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。
（9）HRP（RZ>3.0）。
（10）Sephadex G-25层析柱（2 cm×50 cm）。
（11）搅拌器，分光光度计，离心机。
（12）透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以 NaIO4 先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基，然后再与 Ig 上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近 70% 的 HRP 和 Ig 结合，99% 的 Ig 与酶结合，酶与 Ig 的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
1. 原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭 HRP 上残留的 α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson 等改用在低 PH 下使 NaIO4 氧化 HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP 步骤。HRP 经 NaIO4 氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用 NaBH4（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。
2. 标记步骤：
（1）称取 5 mgHRP 溶解于 1 ml 蒸馏水中。
（2）于上液中加入 0.2 ml 新配的 0.1M NaIO4 溶液，室温下避光搅拌 20 分钟。
（3）将上述溶液装入透析袋中，对 1 mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析，4℃ 过夜。
（4）加 20μl 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯 RP的PH 升高到 9.0~9.5，然后立即加入 10 mg IgG（抗体，或 SPA5 mg）在 1 ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌 2 小时。
（5）加 0.1 ml 新配的 4 mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2 小时。
（6）将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS 透析，4℃ 过夜。其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的（6）、（7）、（8）。
3. 结果判定：
除标记物 IgG 量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量（mg/ml）=（OD280nm-OD403nm×0.3）×0.624. 试剂及器材：
（1）0.1M NaIO4：称取241 mg 高碘酸钠（广州化学试剂厂，批号 830602）溶于蒸馏水 10 ml中。
（2）1 mM PH4.4 醋酸钠缓冲液：
0.2M NaAc（1.361 克/50 ml）3.7 ml
0.2M HAc（0.601 ml/50 ml）6.3 ml 加蒸馏水至2,000 ml.
（3）0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液：
Na2CO3 0.32 克
NaHCO3 0.586 克
加蒸馏水至50 ml
再用蒸馏水作 20 倍稀释，即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。
（4）NaBH4溶液（4 mg/ml）：
临用时称取 NaBH44 mg溶于1 ml 蒸馏水中。
（5）其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
（三）工作浓度的选择
在 免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非 特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原（或抗体）物理吸附于固相载 体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或抗Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工 作浓度。
其步骤为：先将抗原（或抗体）用 0.05M PH9.6 包被缓冲液稀释为 10 μg/ml 左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1 ml,4℃ 过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤 3 次。酶标记抗体用1%BSA-PBS 液 依次稀释成 1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600??（根据据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔 0.1 ml,37℃ 孵育 1小时后洗涤。然后加底物液，每孔 0.1 ml,37℃10~30分钟。以 2M H2SO4 0.05 ml 终止反应。结果判定主要以 ELISA 比色仪读取各孔 OD 值。并以OD 为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得 OD 值为 1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见 ELISA 部分。
要说明的是，本法为 ELISA 直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立 ELISA 实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到最适的实验条件。
（四）注意事项
1. 在具备高质量 HRP 的条件下，所要标记的抗体也要活性高， 效价高（最低 1∶16）， 纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
2. 所使用试剂的PH 和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质）。否则，影响标记效果。
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在 25℃ 为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. 浓的标记物相当稳定，常加入 30~40% 甘油于-10℃ 下保存。4℃ 可保存 1~2 年，但稀释成 1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在 12 小时内用完。切忌反复冻融。
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记 SPA 等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是 酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前， 高质量的酶（如辣根过氧化物酶，简称 HRP）国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
（一）酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶， 原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：
（1）来源方便，易于纯化；
（2）比活性高，性质稳定；
（3）酶活性和量能用简单方法测定。 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和硷性磷酸酶（AP），其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。由于辣根 过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋 白，糖含量 18% HRP 由多个同功酶组成，分子量为 40,000, 等电点为 PH3~9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶 溶于水和58% 以下饱和度硫酸铵溶液。HRP 的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275 nm，一般以 OD403nm /OD275 nm 的比值 RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶 RZ 值应在 3.0 左右（最高可达3.4）。RZ 值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变 性后，RZ值仍可不变。HRP 的催化反应需要底物过氧化氢（H2O2）和供氢体（DH2）。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料（D）。
| 酶促反应的过程如下： HRP DH2+H2O2────→D+2 H2O |
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB（3.3-二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。 5AS（5-氨基水杨酸）早期曾用于 ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT（邻联甲苯胺）的特点是能产生鲜艳的蓝绿 色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD（邻苯二胺）和 TMB（四甲基联苯胺）。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者 比前者可高 4 倍以上。另外，还有一种供氢体称 ABTS[2, 2'-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）],其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS 与 TMB 皆是 值得被优选的供氢体。
由于 HRP 的底物 H2O2 本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的 H2O2 不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明 H2O2 已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
（二）HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种， 根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备 HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法
1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
2. 标记步骤：
（1）称取 HRP25 mg 溶于 1.25% 戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
（2）反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1 ml/1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于 5 ml,则以 PEG 浓缩至 5 ml。放置25 ml 小烧杯中，缓慢搅拌。
（3）将待标记的抗体 12.5 mg 用生理盐水稀释至 5 ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
（4）用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25 ml，继续搅拌 3 小时。
（5）加 0.2M 赖氨酸 0.25 ml，混匀后，置室温 2 小时。
（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4℃ 1 小时。
（7）3000 rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15 M PH7.4 的 PBS 中。
（8）将上述溶液装入透析袋中，对 0.15 M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10,000 rpm离心 30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3. 结果判定：
（1）定性及效价滴定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定 其活性。最后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（见本节（三）工作浓度的选择）。
（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定（光程 1 cm）。
酶量（mg/ml）=OD403nm×0.4
IgG 量（mg/ml）=OD280nm-OD403nm×0.42）×0.94×0.62酶量（mg/ml）IgG 量（mg/ml）酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 440,000 160,000 IgG量（3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2~4% 的酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
（1）0.1 M PH6.8磷酸缓冲盐水（PBS）：取0.2M Na2 HPO4 49 ml， 0.2M NaH2PO4 51 ml,NaCl 1.8 克，加蒸馏水至 200 ml。
（2）1.25% 戊二醛液：取 25% 戊二醛50 ml与PH6.8的PBS1 ml 混合。
（3）1M PH9.5 碳酸盐缓冲液：取 1M 碳酸钠3 ml 与 1M 碳酸氢钠7 ml 混合。
（4）0.2M 赖氨酸溶液：称赖氨酸 29.2 mg 溶于0.01M PH 9.5碳酸缓冲液 1 ml 中。
（5）0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。
（6）PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
（7）萘氏试剂及聚乙二醇（PEG,MW2000）。
（8）纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。
（9）HRP（RZ>3.0）。
（10）Sephadex G-25层析柱（2 cm×50 cm）。
（11）搅拌器，分光光度计，离心机。
（12）透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以 NaIO4 先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基，然后再与 Ig 上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近 70% 的 HRP 和 Ig 结合，99% 的 Ig 与酶结合，酶与 Ig 的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
1. 原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭 HRP 上残留的 α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson 等改用在低 PH 下使 NaIO4 氧化 HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP 步骤。HRP 经 NaIO4 氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用 NaBH4（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。
2. 标记步骤：
（1）称取 5 mgHRP 溶解于 1 ml 蒸馏水中。
（2）于上液中加入 0.2 ml 新配的 0.1M NaIO4 溶液，室温下避光搅拌 20 分钟。
（3）将上述溶液装入透析袋中，对 1 mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析，4℃ 过夜。
（4）加 20μl 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯 RP的PH 升高到 9.0~9.5，然后立即加入 10 mg IgG（抗体，或 SPA5 mg）在 1 ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌 2 小时。
（5）加 0.1 ml 新配的 4 mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2 小时。
（6）将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS 透析，4℃ 过夜。其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的（6）、（7）、（8）。
3. 结果判定：
除标记物 IgG 量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量（mg/ml）=（OD280nm-OD403nm×0.3）×0.624. 试剂及器材：
（1）0.1M NaIO4：称取241 mg 高碘酸钠（广州化学试剂厂，批号 830602）溶于蒸馏水 10 ml中。
（2）1 mM PH4.4 醋酸钠缓冲液：
0.2M NaAc（1.361 克/50 ml）3.7 ml
0.2M HAc（0.601 ml/50 ml）6.3 ml 加蒸馏水至2,000 ml.
（3）0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液：
Na2CO3 0.32 克
NaHCO3 0.586 克
加蒸馏水至50 ml
再用蒸馏水作 20 倍稀释，即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。
（4）NaBH4溶液（4 mg/ml）：
临用时称取 NaBH44 mg溶于1 ml 蒸馏水中。
（5）其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
（三）工作浓度的选择
在 免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非 特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原（或抗体）物理吸附于固相载 体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或抗Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工 作浓度。
其步骤为：先将抗原（或抗体）用 0.05M PH9.6 包被缓冲液稀释为 10 μg/ml 左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1 ml,4℃ 过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤 3 次。酶标记抗体用1%BSA-PBS 液 依次稀释成 1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600??（根据据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔 0.1 ml,37℃ 孵育 1小时后洗涤。然后加底物液，每孔 0.1 ml,37℃10~30分钟。以 2M H2SO4 0.05 ml 终止反应。结果判定主要以 ELISA 比色仪读取各孔 OD 值。并以OD 为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得 OD 值为 1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见 ELISA 部分。
要说明的是，本法为 ELISA 直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立 ELISA 实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到最适的实验条件。
（四）注意事项
1. 在具备高质量 HRP 的条件下，所要标记的抗体也要活性高， 效价高（最低 1∶16）， 纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
2. 所使用试剂的PH 和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质）。否则，影响标记效果。
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在 25℃ 为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. 浓的标记物相当稳定，常加入 30~40% 甘油于-10℃ 下保存。4℃ 可保存 1~2 年，但稀释成 1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在 12 小时内用完。切忌反复冻融。
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