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古朵整理:ELISA常见问题及解决措施

发布时间:2018-08-10 13:39 点击次数:

ELISA实验因其灵敏度较高、特异性较好而广泛应用于临床上,但操作中的各环节对检测效果影响较大,稍不注意,就有可能导致显色不全、花板。

问题主要集中在这几个方面:选材、加样、孵育、洗板、显色、终止、读板。详情可见下表

操作步骤

可能原因

解决办法

选  材

选择质量优良的检测试剂,操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。

   

 

 

   

 

1.血清或血浆标本分离不好即进行加样;

2.手工操作中,加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)

3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。

 

1.标本为血清:最好将血液先自然存放1-2小时后,再用3000rmp离心15分钟;标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管,采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次,放置一段时间后,3000rpm离心15分钟;若在几天内检测,可放在2-8℃冰箱中,若要贮存,则置于-20℃的低温冰箱内。

2.加样后及时放入孵箱。

3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

4.如果采用AT或其他全自动加样,最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。

5.标本较多时,请分批操作。

 

     

 

1.孵育时未贴封片或加盖,使标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁,难于清洗彻底;

2.孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。

1.贴封片或加盖;

2.按说明步骤严格控制操作时间。

 

 

 

   

 

1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。

2.采用半自动洗板机洗板时,洗液量不足,导致洗板不彻底;洗板针堵塞,抽吸不完全;洗板不畅,导致洗板效果差。

3.反应板过多造成洗板等待时间长。

1.保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干;

2.合理安排,或多用几台洗板机。

 

     

1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂;

2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。

 

1. 显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用;

2. 加样时保持显色剂不外流;

3.AB液应避免接触金属器械。

     

加终止液时产生较多气泡,导致假阳性增加。

加终止液时应避免产生气泡。

 读   

读板时板底不清洁。

应保证酶标板清洁。

 全过程

1.整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸

2.实现ELISA检测标准自动化,有效提高检测质量。