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古朵浅谈:ELISA检测试验四种常用方法的优缺点

发布时间:2018-08-10 13:34 点击次数:

ELISA是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体、或激素的免疫分析技术。酶联免疫吸附试验的标准程序,通常是把蛋白、抗体、或激素等(即抗原)直接或是以捕捉抗体(capture Ab)固定在固相载体上,再加入一级检测抗体(primarydetection Ab),形成一个抗原抗体的复合物。如果该抗体已经用酶(enzyme)标记了,即可用来直接测定抗原的量,若无,则可利用另一个酶标记的二级抗体来测定抗原的量。测定抗原量的方法是加入该酶的底质(substrate),作用后产生出现的颜色深浅和样本中的抗原量呈正比的关系,依此原理计算出样本中的抗原总量或浓度。
 
1.直接法(direct ELISA)
将抗原直接固定在固相载体上,加入酶标记的一级抗体,即可测定抗原总量,此一级抗体的特异性非常重要。
优势:操作手续简短,因无须使用二抗可避免交互反应。
缺点:试验中的一抗都得用酶标记,但不是每种抗体都适合做标记,费用相对提高。
 
2.间接法(indirect ELISA)
此测定方法与直接法类似,差别在于一级抗体没有酶标记,改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。
优势:二抗可以加强信号,而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。
缺点:交互反应发生的机率较高。
 
3.双抗体夹心法(sandwich ELISA)
被检测的抗原包被在两个抗体之间,其中一个抗体将抗原固定于固相载体上,即捕捉抗体。另一个则是检测抗体,此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量;或不标记,再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取,才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。
优势:高灵敏、高专一性,抗原无须事先纯化。
缺点:抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
 
4.竞争法(competitive ELISA)
样本里的抗原(自由抗原)和纯化并固定在固相载体上的抗原(固定抗原)一起竞争相同的抗体,当样品里的自由抗原越多,就可以结合越多的抗体,而固定抗原就只能结合到较少的抗体,反之亦然。经清洗步骤,洗去自由抗原和抗体的复合物,只留下固定抗原和抗体的复合物,拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较,根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。
优势:可适用比较不纯的样本,而且数据再现性很高。
缺点:整体的敏感性和专一性都较差。
 
最新ELISA技术:
基于细胞法(cell-based ELISA):
是一种新的定性蛋白检测技术,将细胞直接在微孔板里培养,待检测时,不需抽提蛋白和裂解细胞,便可直接测量微孔板里蛋白经刺激或抑制作用后的变化。
优势:无需裂解细胞,所以目标蛋白损失最少,可测定完整细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞。
缺点:不能测定抗原量。