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大肠杆菌的耐药性分析---古朵生物详解

发布时间:2018-08-08 15:56 点击次数:

  1. 细菌分离纯化:无菌采集肝脏划线接种于麦康凯琼脂培养基,伊美兰琼脂培养基中,37℃恒温培养12-24h,用普通培养基进行纯化培养;
  2. 细菌形态特征:无菌挑去上述纯化培养菌,革兰氏染色镜检
电镜观察:FQ-180菌液培养7h后,3000r/min离心5min,弃上清,ddH2O洗涤2次重悬,取15ul滴在Formver膜覆盖在铜网上,2min后滴加磷钨酸负染2min,待铜网烘干后,在投射电子显微镜下观察
  1. 生化试验:将初步分离到的可疑菌落进行吲哚试验,MR试验,VP试验,淀粉E试验,枸橼酸钠利用试验,乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇发酵试验,产硫化氢试验,尿素酶试验,触酶试验,运动性试验,三塘铁斜面穿刺试验(或用ATB全自动生化鉴定系统和ID32E肠道菌鉴定试剂条进行生化试验)
  2. 药敏试验:按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行实验操作和结果判断(所采用的抗生素见图1
  3. 血清型鉴定:采用玻板凝集反应对分离株进行血清型鉴定,先用多因子血清通过玻板凝集试验筛选可能的血清型,然后再与大肠杆菌单因子血清各10ul在玻板上混匀,30S内出现明显凝集者为阳性反应,同时以菌液与0.5%碳酸生理盐水混合物作对照,观察有无自凝现象
  4. PCR鉴定:将分离纯化后的菌株按照煮沸法制备细菌DNA模板,以大肠杆菌phoA基因的特异性引物进行PCR鉴定
  5. 毒力基因与耐药性的关系:根据药敏试验的结果,针对药敏性较为普遍的抗生素的耐药基因情况,找出其规律,并研究独立基因与耐药性的关系,然后采用多重PCR方法检测耐药基因,如4种氨基糖苷类耐药基因aadA1aac2aac4aphA33种四环素类耐药性基因tetAtetC以及tetM的流行情况
  6. 提取DNA及16s rDNA鉴定:提取细菌基因组DNA,并使用16s rRNA Bacterial Identification PCR kit的特异性引物进行扩增,最后进一步对PCR扩增的DNA克隆、测序并开展序列分析
  7. 致病性试验:参照A.E.Williams等方法,设置16组试验组,1组阴性对照,实验组每株菌攻毒4只小组,按0.2ul/只腹腔注射菌液浓度为1*109ef/ml,对照组4只小鼠注射等剂量的生理盐水,观察发病及死亡情况,无菌采集死亡小鼠肝脏、心脏进行分离鉴定
  8. 鸡胚致死试验:将待测大肠杆菌分别划板,挑去平板上的单菌落,与LB液体培养基中37度摇床过夜培养,然后离心,经PBS2次,并用PBS悬液进行倍比稀释,取0.1ml稀释液经尿囊腔接种12日龄SPF鸡胚大约100-300CFU/只,每组10只,同时取0.1ml稀释液涂板,做细菌计数,对照分两组,一组直射PBS,一组不注射,计每日死亡数,质4d,计胚胎致死率
  9. 病毒分离:收集病样加入青霉素(终浓度1000U/ml)和链霉素(终浓度1000U/ml),于4作用4h以上,取0.2ul接种于9-10日龄鸡胚羊膜腔,37培养72h4过夜后收集羊水,每份样品接种3枚鸡胚,采集的羊水用1%鸡红细胞进行血凝试验,判断病毒是否成功分离,如果标本呈阳性,采用血凝抑制试验进一步坚定,标本呈阴性则继续自传3