标签：考马斯亮蓝 蛋白标准品 古朵生物 化学试剂

摘要 : 蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便。下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。

实验原理

考马斯亮蓝染色法（coomassie blue staining）又称 Bradford 法，是 Bradford 于 1976 年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由 465 nm 变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

(1) 灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。

(2) 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和严格地控制时间。

(3) 干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

(1) 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

(2) 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。

试剂与器材

一、试剂

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL。

二、标准和待测蛋白质溶液

1. 标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。

2. 待测蛋白质溶液

人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。

三、器材

试管 1.5 × 15 cm（× 6），试管架，移液管 0.5 mL（× 2）；1 mL（× 2）；5 mL（× 1）；恒温水浴；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取 7 支试管，按下表平行操作。



二、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

注意事项

1. 在试剂加入后的 5～20 min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

2. 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

3. 利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。

上海古朵生物科技有限公司是一家集产品研发、销售、服务于一体的高科技生物企业。产品主要涵盖生化试剂、分子生物学试剂、细胞培养、免疫学产品及实验耗材等。本考马斯亮蓝染色套装（Commassie Blue Staining Kit）采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝 G-250 为染料，可用于 SDS-PAGE 或非变性 PAGE 等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或 Western 转膜后 PAGE 胶上残余蛋白的检测。