标签：流式细胞术 Flow CytometryFCM 流式细胞仪 古朵生物 免疫荧光标记

摘要: 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

流式细胞仪（Flow Cytometer，FCM），又称荧光激活的细胞分选器（fluorescence activated cell sorter，FACS），作为进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体力学、图像技术、细胞生物学、免疫学理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为生物医学实验室的「CT」。流式细胞术已经成为一种用途最广泛和最先进的细胞分析技术，在细胞生物学、血液学、肿瘤学、免疫学等基础和临床医学领域发挥着重要作用。

流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由流动室与液流系统、激光源与光学系统、光电管与检测系统、计算机与分析系统四部分组成。

关键词: 流式细胞术 Flow CytometryFCM 流式细胞仪

一、流式细胞仪的细胞分析原理

首先将待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色（间接免疫荧光染色或直接免疫荧光染色）后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的作用下，细胞排成单列从流动室喷嘴口喷出，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交，该区称为测量区。

利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号，再经过信号放大、加工处理后存储于计算机中，进而利用相关软件进行多参数统计分析，从而实现了细胞的定量分析。
 
二、流式细胞仪的细胞分离原理

流式细胞仪对细胞的分选是通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。在具分选功能的流式细胞仪流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，这个振荡装置可将自喷嘴射出的液束破碎成千万个小滴，流动的细胞同时也就被分散在这些小水滴中。这时给流束一个电脉冲信号，使小水滴就全部带上电荷。当带有不同电荷的细胞液流经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小水滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的水滴就进入中间的废液容器中，从而实现了细胞的

三、免疫荧光标记样品的流式细胞分析

利用流式细胞术对细胞表面、细胞质、细胞核等部位的的抗原或受体进行分析时，即可采用直接免疫荧光标记，也可采用间接免疫荧光标记。标记好的细胞可直接利用流式细胞仪进行检测并根据所测定的荧光强度或阳性百分率对抗原或受体的分布、密度等进行评定。目前，基于免疫荧光标记流式分析技术的免疫分型已成为诊断白血病等血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一，并成为国际上公认的通用方法。

下文将通过对小鼠白细胞表面受体的检测简要说明一下直接免疫标记的流式细胞分析的过程。

（一）试剂

1、1% （w/v）多聚甲醛溶液，溶剂为 PBS，4 °C 保存。

2、含有 2％ FCS 的 DMEM 培养基。

3、PBS（pH 7.2）：4.3 mM Na2 HPO4，2.7 mM KCl，1.8 mM KH2PO4，137 mM NaCl。

4、红细胞裂解缓冲液（10 ×）（4 °C 保存）：

100 mM 碳酸氢钠

10 mM EDTA

1.5 M 氯化铵

5、荧光素标记好的抗体（常按照 1 μg /ml 被溶解在含有 2％ FCS 的 DMEM 培养基中避光保存）。

（二）操作步骤

1、剪断小鼠尾巴取血 200 μl，并将血收集入一盛有 12 ml  PBS 和适量肝素的 15 ml 尖底离心管中。

2、700 g 离心 5 分钟，小心弃掉上清，重悬细胞沉淀，加入 3 ml 红细胞裂解液，颠倒离心管数次混匀细胞。

    室温孵育 5~10 分钟，裂解红细胞。

    700 g 离心 3 分钟，小心弃掉上清，用 3 ml 加有 2％ FCS 的 DMEM 培养基重悬细胞（将细胞密度调整在 5×106~1×107／ml）。

    700 g 离心 3 分钟，小心弃掉上清，加入 1 ml 荧光素标记好的抗体，在避光条件下置冰块上轻轻晃动 20~30 分钟。

6、700 g 离心 3 分钟，小心弃掉上清，用 3 ml 加有 2％ FCS 的 DMEM 培养基重悬细胞。

7、700 g 离心 3 分钟，小心弃掉上清，用 2 ml 多聚甲醛溶液重悬细胞。

8、700 g 离心 3 分钟，小心弃掉上清，用 500 μl 多聚甲醛溶液重悬细胞。

9、用铝箔包裹好离心管，4 °C 避光保存直至进行流式分析。

10、上机检测和结果分析。

（三）注意事项 免疫学实验技术论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

1、所有操作均应尽可能在 4 °C 进行。

2、洗涤要充分，防止游离抗体发生非特异性结合。

3、细胞活性要好。

4、阴性对照应与检测靶抗原所用抗体是同一类或同一亚类。