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酶联免疫吸附测定法技术原理分析!

人阅读 发布时间:2016-05-12 11:18


酶联免疫吸附测定法酶联免疫测定方法是以抗原 和抗体 分子为测定靶标的方法,亦是目前最为常用的实验室诊断方法之一。

基本原理

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。 ② 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标 抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与 标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行 定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA 可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有 3 种必要的试剂:

①固相的抗原或抗体

②酶标记的抗原或抗体

③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。

注意事项

⒈ 正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封闭。

⒉ 在 ELISA 中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:

⑴ 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是 40 孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求 PH 在 9.0~9.6 之间。吸附温度,时间及其蛋白量也 有一定影响,一般多采用 4℃18~24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0 和 10 μg/ml 等)进行包被后,在 其它试验条件相同时,观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 1~10 μg/ml.

⑶ 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取「方阵法」(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

⑷ 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如 OPD 等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条 件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如 TMB 和 ABTS 是当前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间, 以 10-30 分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是 H2O2 在临用前加入。

检测步骤

ELISA 用 血清来检测,首先血液要经过至少半个小时的凝集,然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后,加血清及阴性、阳性对照,还有就是质控品(这是严格的要求,它的 范围必须在质控范围内)。经过一个小时的孵育,然后洗板,加底物,半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分,然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳 性。

检测方法

双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

一、将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。

二、加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

三、加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

四、加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

在 临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如 HBsAg、HBeAg、 AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别 取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异 性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步法检测。

间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

⑴将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原:洗涤除去未结合的抗原及杂质。

⑵加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去。

⑶加酶标抗抗体:与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体,可用酶标羊抗人 IgG 抗体。

⑷加底物显色:颜色深度代表标本中受检抗体的量。

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